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【摘要】 目的 观察nesfatin1对大鼠迷走神经复合体(DVC)内胃扩张敏感神经元和葡萄糖感受神经元放电频率的调制作用,探讨其参与摄食调控的可能机制。方法 采用多管玻璃微电极记录单个细胞单位放电的电生理学方法,观察大鼠DVC区微量注射nesfatin1前后上述两种神经元放电频率的变化,以微量注射9 g/L NaCl作对照。结果 在DVC中记录到经多管微电极给予葡萄糖的109个神经元,有46个神经元放电频率降低(鉴定为GINH);31个神经元放电频率升高(鉴定为GEXC);32个神经元对葡萄糖没有反应。在39个GINH经多管微电极给予nesfatin1,有33个神经元放电频率降低,1个神经元放电频率升高,5个神经元对nesfatin1无反应。在26个GEXC神经元中,有20个神经元放电频率升高,3个神经元放电频率降低,3个神经元对nesfatin1无反应。对89个神经元进行胃扩张(GD)刺激,在DVC中记录到48个神经元被激活(鉴定为GDEXC),21个神经元被抑制(鉴定为GDINH),其余20个神经元对胃扩张无反应。在42个GDEXC神经元中,32个神经元被nesfatin1所兴奋,10个神经元对nesfatin1无反应。在18个GDINH神经元中,16个神经元被nesfatin1所抑制,2个神经元无反应。上述两类神经元经多管微电极给予9 g/L NaCl,注射前后神经元放电频率的变化无统计学意义。结论nesfatin1能够调制DVC胃扩张敏感神经元和葡萄糖感受神经元的兴奋性,这可能是nesfatin1抑制摄食的部分机制。
【关键词】 nesfatin1;迷走神经复合体;胃扩张敏感神经元;葡萄糖感受神经元;电生理学;大鼠,Wistar
EFFECTS OF nesfatin1 ON GASTRIC DISTENSION SENSITIVE NEURONS AND GLUCOSERESPONSIVE NEURONS IN RAT DORSAL VAGAL COMPLEX
WANG WENJIE, JIANG ZHENGYAO (Department of Physiology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, China);
[ABSTRACT] Objective To observe the effects of nesfatin1 on gastric distension sensitive neurons and glucoseresponsive neurons in rat dorsal vagal complex (DVC). Methods Electrophysiological recording was adopted to investigate the changes in firing rate of gastric distension neurons and glucoseresponsive neurons before and after microinjection of nesfatin1 into the DVC, and those received microinjection of 9 g/L NaCl served as controls. Results The record showed 109 neurons in DVC, of which, 31 were activated by glucose and identified as glucoseexcited (glucoseEXC) neurons; 46 were depressed and identified as glucoseinhibited (glucoseINH) neurons; other 32 failed to respond to glucose. Of 26 glucoseexcited neurons examined in response to nesfatin1, 20 were activated, three failed to respond to nesfatin1. Of 39 glucoseinhibited neurons examined in response to nesfatin1, 33 were suppressed, one was activated, and five failed to respond to nesfatin1. Eightynine neurons were recorded in DVC, 69 of them responded to gastric distension (GD), 48 were excited (GDEXC), 21 inhibited (GDINH), and 20 failed to respond to GD. Of 42 GDEXC neurons, 32 were excited, whereas 16 out of 18 GDINH neurons suppressed by nesfatin1. The above two types of neurons were failed to respond to 9 g/L NaCl. Conclusion Nesfatin1 is involved in the modulation of electric activity of GDsensitive neurons and glucoseresponsive neurons in DVC, which is probably a part of its mechanism of foodintake inhibition.
[KEY WORDS] nesfatin1; dorsal vagal complex; gastric distension sensitive neurons; glucoseresponsive neurons; electrophysiology; rats, Wistar
nesfatin1分子是一种由82个氨基酸组成的多肽[1],其前体蛋白nucleobindin2(NUCB2)经过激素转化酶的裂解作用可生成3个片段,一个N端片段(nesfatin1)和两个C端片段(nesfatin2和nesfatin3)。相关研究表明,nesfatin1作为一个饱食分子,侧脑室注射有抑制摄食的作用[1],并且注入nesfatin1的抗体Ab24后抑制摄食的作用消失,但其受体尚未发现。nesfatin2和nesfatin3没有此作用。nesfatin1分布于下丘脑室旁核、视上核、弓状核和下丘脑外侧区及脑干孤束核(NTS)。禁食24 h可使室旁核NUCB2 mRNA 表达和nesfatin1 含量下降,而饥饿24 h后的再进食诱发室旁核nesfatin1神经元的cFos表达[2]。最近MAEJIMA等[3]报道,第三脑室注射 nesfatin1诱发cFos的表达主要位于室旁核和NTS。这种选择性的cFos表达,提示除室旁核之外,NTS是nesfatin1抑制摄食的重要靶点之一。形态学的研究结果已证明,室旁核催产素神经元发出下行纤维支配NTS[4]。胃扩张或营养素引发的饱感信号通过迷走神经传入纤维或外周循环中的激素传递到NTS。NTS中含有胃扩张敏感型神经元(GDEXC)和胃扩张抑制型神经元(GDINH) [5],胃扩张兴奋型神经元感受胃扩张产生的饱感信号,参与摄食的调控。以往的研究结果表明,脑内有两个部位对细胞外液葡萄糖浓度的变化敏感,其一是下丘脑,其二是脑干的迷走神经复合体(DVC),这两个部位的一些神经元通过葡萄糖作为信号改变它们的放电频率[5]。以往的文献已证明,下丘脑和孤束核的葡萄糖感受神经元参与摄食调控[67]。本实验中,我们采用电生理学方法鉴定DVC中GDEXC和葡萄糖感受神经元,通过观察nesfatin1对这些神经元放电活动的影响,探讨nesfatin1抑制摄食的可能机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物
健康成年Wistar大鼠共80只(由青岛市药检所提供),雌雄不拘,体质量220~280 g。置于室温(22±2)℃及1212 h昼夜循环光照条件下饲养,喂以标准的大鼠专用食物,自由饮水。实验前至少适应环境7 d。
1.2 实验方法
1.2.1 胃部手术
实验大鼠以200 g/L氨基甲酸乙酯(1.25 g/kg)腹腔麻醉。腹部剑突下作1 cm的皮肤切口,分离肌肉和筋膜,打开腹腔。于胃大弯部作1 cm切口,置入薄膜囊,经聚乙烯软管连至5 mL注射器,实验时注入温生理盐水(36 ℃)扩张刺激胃壁机械感受器,缝合切口。
1.2.2 电生理实验
麻醉状态下的大鼠俯卧固定于立体定位仪(Narishige SN3, Tokyo, Japan)上,剪除头部皮毛,暴露颅骨,调整前后囟于同一水平面。用牙科钻去除小脑上方的颅骨,剥除小脑脑膜,暴露脑实质,必要时用棉球、明胶海绵止血,最后以30~40 g/L的琼脂生理盐水覆盖保护脑皮质,尽量使琼脂平面与前后囟平面相同,以维护神经元放电的稳定性。制备三管玻璃微电极,尖端总直径约3~10 μm、阻抗5~20 MΩ,用于电生理记录和多管微电极给予nesfatin1。记录电极内注入滂胺天蓝,其他两管分别注入nesfatin1溶液、9 g/L NaCl溶液,分别连接4导压力注射仪(PM 2000B, Micro Data Instrument Inc, USA)的两个加压注射管道。将电极固定在立体定位仪的电极支架上。
按照PaxinosWatson图谱定位DVC区的范围:前囟后11.3~14.3 mm,旁开0.7~1.7 mm,深度 7.5~8.7 mm。将电极移至DVC区对应的上方,旋转旋钮下降电极,根据监听器监测的声音变化,以及监视器显示基线漂移突然变小的现象,判断电极尖端是否进入空气与琼脂界面。用液压推进器将微电极送至接近预定深度后,搜寻神经元开始记录,记录的电信号经微电极放大器(MEZ8201,NIHON KOHDEN)显示于记忆示波器上(VC11, Nihon Kohden), 放电频率由“生物电信号直方图记录”软件(Histogram Ver.1.0, 上海)分析处理。放电频率稳定至少120 s后,胃腔薄膜囊内注入2~5 mL温生理盐水,持续扩张胃壁10~30 s后抽出生理盐水,观察神经元放电频率的变化。胃扩张后放电频率比扩张前增加20%以上的神经元为GDEXC,放电频率比扩张前降低20%以上的神经元则为GDINH。待放电频率恢复并稳定至少120 s,多管微电极给予 nesfatin1,观察3~4 min,待放电频率恢复并稳定至少120 s,多管微电极给予生理盐水作为对照。胃扩张或加药前后放电频率变化超过20%的神经元列入统计。
另外,制备四管玻璃微电极,记录电极内注入滂胺天蓝,其他三管分别注入nesfatin1溶液、葡萄糖溶液、9 g/L NaCl溶液,分别连接4导压力注射仪(PM 2000B, Micro Data Instrument Inc, USA)加压注射管道。将电极固定在立体定位仪电极支架上。在DVC区找到放电神经元并稳定至少2 min后,将0.5 mol/L葡萄糖溶液经多管微电极压力注射到神经元表面,观察神经元放电频率的变化。注射葡萄糖后放电频率比注射前增加20%以上,鉴定为葡萄糖敏感神经元(GSEXC);注射葡萄糖后放电频率比注射前降低20%以上,鉴定为葡萄糖抑制神经元(GSINH),待放电频率恢复并稳定至少120 s,多管微电极给予 nesfatin1观察3~4 min,待放电频率恢复并稳定至少120 s,多管微电极给予生理盐水作为对照。注射葡萄糖或nesfatin1前后放电频率变化超过20%的神经元列入统计。
1.2.3 组织学检査电极记录位置
每次电生理学实验结束后,利用离子电渗方法(10 μA, 20 min),将电极内的滂胺天蓝电泳入脑组织,以标记电极尖端所在的位置。同时,大鼠经左心室相继灌注生理盐水200 mL、40 g/L的多聚甲醛200 mL。大脑取出后冷冻30 min,用冷冻切片机作50 μm厚冠状切片,在显微镜下观察注射点的位置。只有注射位置正确的大鼠,其数据才被用于统计分析中。齐鲁医学杂志2010年6月第25卷第3期 Med J Qilu, June 2010, Vol.25, No.3
1.3 统计学处理
应用SPSS 16.0及PPMS 1.5[8]统计学软件进行数据处理,实验结果用±s表示,数据间比较采用t检验。
2 结果
2.1 胃扩张对DVC神经元电活动的影响
在DVC内记录到89个神经元,其中有48个神经元胃扩张后放电频率从(9.37±2.00)Hz 升高到 (14.02±1.88)Hz,差异有显著意义(t=4.04,P<0.01);放电频率平均升高了(52.69±19.44)%,鉴定为GDEXC。有21个神经元胃扩张后放电频率从(10.01±2.14)Hz 降低到(5.69±1.28)Hz,差异有显著性(t=4.11,P<0.01);放电频率平均降低(42.26±10.67)%,鉴定为GDINH。
2.2 nesfatin1对DVC神经元的影响
在48个GDEXC中,对其中42个经多管微电极给予nesfatin1,有32个神经元的放电频率从(9.14±2.07)Hz 升高到(13.08±2.25)Hz,差异有显著性(t=3.98,P<0.01);放电频率平均升高了(40.80±15.96)%;10个神经元对nesfatin1没有明显反应。在21个GDINH中,共有18个神经元经多管微电极给予nesfatin1,其中16个放电频率从(9.04±1.70)Hz 降低到(6.10±1.63)Hz,差异有显著性(t=3.29,P<0.01),放电频率平均降低了(32.87±10.23)%。 3个神经元对nesfatin1没有明显反应。
2.3 葡萄糖对DVC神经元电活动的影响
在DVC内记录到109个神经元,给予葡萄糖加以鉴定。其中有31个神经元放电频率从(8.89±1.83)Hz 升高到(13.37±2.03)Hz,差异有统计学意义(t=4.05,P<0.01),放电频率平均升高了(52.38±17.11)%;有46个神经元胃扩张后放电频率从(8.81±2.11)Hz 降低到(5.49±2.05)Hz,差异有显著性(t=3.34,P<0.01),放电频率平均降低(38.75±13.17)%。
2.4 nesfatin1对葡萄糖感受神经元的影响
在31个GSEXC中,对其中26个经多管微电极给予nesfatin1,其中有20个神经元放电频率从(9.14±2.07)Hz 升高到到(13.08±2.25)Hz,差异有显著性(t=4.57,P<0.01),放电频率平均升高了(40.80±15.96)%;3个神经元对nesfatin1没有明显反应。在46个GSINH中,共有39个神经元经多管微电极给予nesfatin1,其中33个放电频率从(8.31±2.22)Hz 降低到(4.89±2.13)Hz,差异有显著性(t=4.21,P<0.01),放电频率平均降低了(42.68±14.15)%;5个神经元对nesfatin1没有明显反应。
3 讨论
正常情况下,机体摄食、能量调控处于动态平衡,从而使机体得以维持自身的能量稳定。许多肽类都参与该代谢当中,如促进摄食的orexin、神经肽Y、刺鼠相关蛋白、leptin、黑色胞刺激素及nesfatin1等[5]。众所周知,饱餐之后胃壁受到机械扩张,而胃壁有丰富的机械感受纤维支配,其中大多数通过迷走神经传入纤维上行至NTS。胃扩张能粗略地模仿进食后的胃肠系统引起的饱感效应,胃的机械性感受器兴奋可以作为摄食的饱感信号,抑制摄食行为。本实验结果表明,nesfatin1可以使GDEXC的放电频率增加,这与最近文献报道的扩张胃可以激活NTS内侧的瘦素敏感神经元,从而抑制摄食相一致[8]。提示nesfatin1使GDEXC的放电频率增加,强化了饱感信号,这可能是nesfatin1在NTS 抑制摄食的部分机制之一。最近MAEJIMA等[3]报道,第三脑室注射 nesfatin1诱发cFos的表达主要位于室旁核和NTS。这种选择性cFos表达,提示除室旁核之外,NTS是nesfatin1抑制摄食的重要靶点之一。形态学的研究已证明,室旁核催产素神经元发出下行纤维支配NTS[4]。
此外,本实验结果还观察到,经多管微电极给予nesfatin1可以调制NTS葡萄糖感受神经元的兴奋性。NTS葡萄糖感受神经元属于脑干儿茶酚胺能A2细胞群,NTS nesfatin1神经元是酪氨酸羟化酶阳性的儿茶酚胺能神经元。由此推测,本实验记录的葡萄糖感受神经元可能是nesfatin1神经元。nesfatin1可以调制NTS葡萄糖感受神经元的兴奋性,这也可能是nesfatin1在NTS 抑制摄食的部分机制之一。
综上所述,nesfatin1可以使GDEXC的放电频率增加,强化饱感信号;nesfatin1可以调制NTS葡萄糖感受神经元的兴奋性,这可能是nesfatin1在NTS 抑制摄食的部分机制之一。
【参考文献】
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