IFNγ+874位点单核苷酸多态性和蛋白表达水平与肠道病毒71感染关系

【摘要】  　　目的 研究干扰素Ⅱ型(IFNγ)基因+874位点单核苷酸多态性及IFNγ在血清中表达水平与肠道病毒71 (EV71)感染的关系，探讨EV71感染的遗传易感因素。方法 取急性期手足口病病儿粪便进行病毒分离，序列特异性引物聚合酶链反应(PCRSSP)技术检测EV71感染者及正常对照儿童IFNγ基因第一内含子+874位点T/A单核苷酸多态性；ELISA法测定血清中IFNγ的表达水平。结果 78例手足口病病儿中有43例为EV71感染。EV71感染病儿血清中IFNγ的水平显著高于正常对照组（t=6.477,P<0.01）。EV71感染病儿IFNγ基因型与对照组比较差异有显著性（χ2=6.149，P<0.05）。EV71感染病儿等位基因频率与对照组比较差异有显著性（χ2=7.486，P<0.05）。EV71一般感染组IFNγ基因型分布与脑炎组相比，差异无显著意义（P＞0.05），脑炎组IFNγ等位基因A频率明显高于一般感染组（χ2=6.211，P<0.05）。结论 IFNγ表达水平和其基因第一内含子+874位点多态性与EV71感染有关，与是否发生EV71脑炎有一定相关性。

【关键词】  肠道病毒71；干扰素Ⅱ型；多态性,单核苷酸

　　RELATIONSHIP BETWEEN THE PLASMA LEVEL OF IFNγ AND THE POLYMORPHISM OF IFNγ SINGLE NUCLEOTIDE WITH ENTEROVIRUS 71 INFECTION

　　ZHAO NA, CHEN ZONGBO, QIAN NA, et al

　　(Department of Pediatrics, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);
　　［ABSTRACT］ Objective To study the relationship between the plasma level of interferongamma (IFNγ) and the polymorphism of IFNγ single nucleotide (SNP) with the enterovirus71 (EV71) infection.  Methods Reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) was used to detect the specific primers of EV71 in the faeces of patients with hand, foot and mouth disease (HFMD). The plasma levels of IFNγ were detected by enzymelinked immunosorbent assay.  Results EV71 was positive in 43 specimens from 78 children with HFMD. Compared with that of the normal children, the plasma levels of IFNγ of the patients were significantly increased (t=6.477,P<0.01). In EV71 group AA genotype was more common than in the normal group (χ2=6.149,P<0.05). In EV71 group, the IFNγ A allele was more common than in normal immune group (χ2=7.486,P<0.05). In EV71 group, there was no significant difference in the distribution of frequency of IFNγ gene+874 site between encephalitis children and nonencephalitis children (P＞0.05), but A allele frequency was higher in encephalitis  (χ2=6.211,P<0.05).  Conclusion Plasma level of IFNγ expression and the polymorphism of IFNγ +874A／T single nucleotide may corelate with the enterovirus71 infection, and, with the susceptibility of individual to encephalitis.
   
　　［KEY WORDS］ enterovirus71; interferon type Ⅱ; polymorphism, single nucleotide
   
　　肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科，是儿童手足口病（HFMD)和中枢神经系统感染的主要病原之一。近年来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势[1]。部分病儿可引起严重中枢神经系统损害和急性肺水肿等，病情进展快，在临床上致残率及病死率均较高。目前，EV71的易感因素、发病机制及免疫特点等均未明确，但宿主基因组与EV71易感性的关系越来越受到重视。干扰素Ⅱ型（IFNγ）在机体炎症反应和免疫调节过程中发挥重要作用，可能与EV71感染的发生发展和病理过程密切相关。近年研究显示，IFNγ基因第一内含子区+874位点T/A单核苷酸多态性可以通过改变转录因子的结合位点，影响IFNγ的表达量[2]。鉴于IFNγ在机体抗病毒感染中的作用，本实验采用ELISA和序列特异性引物聚合酶链反应(PCRSSP)技术检测EV71感染病儿IFNγ+874基因位点多态性及血清中IFNγ含量变化，探讨IFNγ免疫遗传因素在EV71感染中可能的作用及临床意义。现将结果报告如下。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料
   
　　2009年5—8月，收集青岛市妇女儿童医疗保健中心和我院临床诊断为手足口病的78例病儿的急性期大便标本和静脉EDTA抗凝血。手足口病诊断标准根据我国卫生部制定的《手足口病预防控制指南(2008年版)》。其中男43例,女35例;年龄11月～6岁，平均年龄2.5岁。所有病儿标本采集时间均在病程前3 d内。于-20 ℃短暂保存。正常对照组32例，为同时期儿外科手术病儿，临床无感染症状，男18例，女14例;年龄2.6～7.5岁;血常规及生化指标检查均在正常参考范围内。

　　1.2  方法

　　1.2.1  EV71检测 

　　按照常规方法处理手足口病病儿大便标本。采用改良的酸性胍酚氯仿一步法(AGPC)[3]提取血中病毒RNA，并进行纯度及含量分析。RTPCR扩增使用Qiagen公司的onestep试剂盒，操作过程严格按照说明书进行。采用针对EV71 VP1段设计型特异引物，上游引物:5′ATGCGTAGAAAGGTGGAGCT3′，下游引物:5′CGCATGTCGGTGAATAGCTC3′，此对引物只扩增鉴别EV71，不与EV家族的其他血清型发生交叉反应。扩增产物长度为341 bp。在临床标本检测中每次操作均设立阳性对照及阴性对照，以确定反应的正确性。取所有RTPCR扩增结果阴性及电泳条带较弱的样本扩增产物加入相应引物, 使用宝生物公司的TaKaRa试剂盒进行二次PCR。RTPCR反应条件：逆转录50 ℃ 30 min；然后95 ℃15 min，94 ℃ 1 min，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，进行40个循环；最后72 ℃ 10 min。二次PCR反应条件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 1 min，52 ℃ 45 s，72 ℃1 min，进行30个循环；最后72 ℃ 5 min。
　
　　1.2.2  血浆IFNγ表达水平测定 

　　取EV71感染病儿和正常对照组儿童静脉EDTA抗凝血1 mL，1 500 r/min离心10 min,吸取上清液,存于-20 ℃待用。采用双抗体夹心ELISA法测定IFNγ的水平,严格按照试剂盒说明书进行操作。

　　1.2.3  IFNγ基因+874位点T/A单核苷酸多态性检测 

　　参照文献[4]，设计扩增IFNγ基因第一内含子+874位点的PCR引物，其中特异正向引物1为5′TTCTTACAACACAAAATCAAATCT3′，特异正向引物2为5′TTCTTACAACACAAAATCAAATCA3′。内参照正向引物为5′TATGATTCTGGCTAAGGAATG3′，通用反向引物为5′TCAACAAAGCTGATACTCCA3′，由上海生工生物技术有限公司合成。其中特异正向引物的3′端碱基(T/A)根据多态性序列与其严格互补，通过特定的PCR反应体系扩增各等位基因的型别特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增条带，长度为262 bp；而内参照正向引物扩增包含有特异性突变位点的DNA片段，长度为440 bp，用于判定整个PCR体系的成功与否。手足口病组与对照组儿童静脉血基因组DNA提取试剂盒为Omega公司产品，PCR使用宝生物公司的TaKaRa试剂盒，参照试剂盒说明书操作。反应条件：95 ℃ 3 min,94 ℃ 1 min，56℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃ 5 min。扩增产物立即在琼脂糖凝胶上电泳检测，剩余产物置于-20 ℃保存。

　　1.3  统计学处理
   
　　采用SPSS 12.0及PPMS 1.5[5]统计分析软件包进行数据处理和统计分析。两组间IFNγ的比较采用t检验。基因型和等位基因频数分布比较采用χ2检验。

　　2  结果

　　2.1  手足口病病儿EV71检测
   
　　EV71型特异引物对78例急性期手足口病病儿大便标本进行RTPCR扩增检测，获得阳性结果40例。对剩余阴性标本进行二次PCR扩增检测,再检出阳性结果3例。正常对照组儿童32例大便标本EV71扩增检测结果全部阴性。

　　2.2  IFNγ表达水平测定
   
　　43例EV71感染病儿及32例对照组儿童血清中IFNγ表达水平分别（50.06±6.98）和（31.09±7.78）ng/L，两组比较差异有显著性（t=6.477,P<0.01）。

　　2.3  IFNγ基因+874位点多态性分析
   
　　IFNγ基因+874位点PCR产物电泳后，按照其+874位点单核苷酸多态性可分为AA、AT、TT等3个不同基因型，见图1。同一标本正向引物1、2及反向通用引物2次扩增后均出现长262 bp的片段为AT基因型，只出现一次长262 bp的片段为AA或TT基因型。所有标本均可扩增出内参照的长440 bp片段。
   
　　EV71感染组IFNγ基因型与对照组比较，差异有显著性（χ2=6.731，P<0.05）。脑炎组IFNγ基因型与一般感染组相比较，差异无显著意义（P＞0.05）。见表1。IFNγ等位基因分析表明， EV71感染组IFNγ等位基因A的频率比对照组IFNγ等位基因A增高（χ2=7.486，P<0.05）。脑炎组IFNγ等位基因A的频率比一般感染组增高（χ2=6.211，P＜0.05）。见表2。表1  各组IFNγ基因+874位点基因型多态性分布比较，表2  各组间IFNγ+874位点等位基因频率分布比较（略）。

　　①为Mark；②、③为AA基因型（长262 bp）；④、⑤为AT基因型（长262 bp）；⑥、⑦为TT基因型（长262 bp）。③～⑦均有内参照条带（长440 bp）。

　　3  讨论
   
　　EV71属于小RNA病毒科，是儿童HFMD和中枢神经系统感染的主要病原之一。对于EV71感染的研究虽然取得了一定进展，但其致病机制和免疫特点方面的研究并不多见，尤其是对EV71感染有着重要影响作用的细胞因子,所以,如何进一步探讨EV71感染与细胞因子的关系,自然为临床医生和基础研究者所重视。EV71感染后的表现是由病毒和宿主的相互作用决定的，不同个体在EV71感染后临床表型复杂多样，包括HFMD、疱疹性咽峡炎，严重者可累及神经系统、呼吸系统和循环系统，形成复杂的疾病谱。这些不同的临床表现，除了与病毒本身的因素有关外，更重要的是由于不同个体对EV71感染所发生的免疫反应不同。细胞介导的免疫反应参与病毒的清除，其中T淋巴细胞分泌的IFNγ具有重要的作用。抗原特异性的免疫反应过程中，IFNγ作为抗原提呈细胞和淋巴细胞增殖、分化的调节剂，参与细胞炎症反应和抗病毒免疫，高表达量的IFNγ对病毒的清除有重要作用。
   
　　IFNγ的合成量为遗传基因所控制，其合成量个体差异很大，主要原因可能为细胞因子基因调节区或启动区的多态性。也可以说，等位基因的多态性直接控制着IFNγ的合成[67]。BIOLO等[8]研究显示，IFNγ低表达型基因AA与IFNγ mRNA水平的降低有关。IFNγ基因位于人类第12号染色体上,共含有3个内含子和4个外显子。IFNγ基因内含子1区存在CA重复序列，其中CA重复为12次的个体，其外周血单个核细胞IFNγ表达量最高。而且，CA重复序列5′端+874位点T/A多态性与CA重复次数相关，即TT为高表达基因型，AA为低表达型基因型，TA为中等表达基因型。由于第一内含子+874位点正好位于转录因子NFκB的结合位点，此处出现SNP直接影响与转录因子的结合能力，从而影响IFNγ的转录。因此，IFNγ基因第一内含子+874位点多态性与某些疾病的发生相关。本研究所选择的30例EV71感染病儿和30例正常对照儿童在年龄、性别等方面差异无显著性，具有可比性。结果显示, EV71感染组IFNγ+874位点A等位基因频率显著高于对照组（P<0.05），而且EV71感染组IFNγ表达水平显著高于对照组（P<0.01），提示A等位基因频率增高和血清IFNγ的表达与EV71感染相关。说明IFNγ+874等位基因多态性与EV71感染的遗传易感性相关联。同时，EV71一般感染组与脑炎组相比，IFNγ基因型分布差异无显著性意义（P＞0.05），脑炎组等位基因A的频率比一般感染组高（P<0.05）。
   
　　由于EV71感染是由遗传因素、机体免疫功能、病毒毒力和环境因素共同作用所致的结果。因此，要确切了解IFNγ基因第一内含子+874位点多态性与EV71感染之间的进一步联系，以及该位点不同基因型与其他细胞因子的相互作用，还需要更深入的研究。

【参考文献】
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　　[8]　BIOLO G, AMOROSO A, SAVOLDI S, et al. Association of interferongamma +874A polymorphism with reduced longterm inflammatory response in haemodialysis patients[J]. Dial Transplant, 2006,21:13171322.