负载抗原DCCIK细胞对NDV 修饰抗原胃癌细胞杀伤作用

【摘要】  目的 探讨负载SGC7901细胞抗原的DCCIK细胞对新城疫病毒(NDV)修饰SGC7901细胞的杀伤作用，探索胃癌新的治疗方法。方法 取健康成人外周血分离单个核细胞，用于诱导培养树突状细胞(DC)及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)。用反复冻融法制备胃癌细胞抗原，用于致敏DC细胞。然后分以下4组进行试验：CIK组、DCCIK组、CIK+ NDV组、DCCIK+NDV组，同时设单独的靶细胞对照(SGC7901)和效应细胞对照(CIK、NDV、DCCIK)。并与化疗药(氟尿嘧啶、顺铂)对SGC7901细胞的杀伤作用进行比较。结果 用NDV修饰抗原后，无论是CIK细胞还是DCCIK细胞对SGC7901细胞的杀伤率均增高。其中负载胃癌细胞抗原的DCCIK细胞杀伤率最高，效靶比为20∶1时，达到83.4%。化疗药物作用48 h时的疗效也不如单纯CIK细胞作用24 h的疗效。结论 负载SGC7901细胞抗原的DCCIK细胞对经NDV修饰抗原的SGC7901细胞的杀伤效果最佳。胃癌的生物治疗效果优于普通化疗。

【关键词】  胃肿瘤;抗原,肿瘤;免疫疗法;树突细胞;杀伤细胞;新城疫病毒

　THE CYTOTOXIC EFFECT OF ANTIGENPULSED DCCIK CELLS ON NDVMODIFIED GASTRIC CARCINOMA CELLS LIU XICHUN, JIANG HAITAO, MAO WEIZHENG (Department of General Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); Objective To study the cytotoxic activity of SGC7901pulsed DCCIK cells on newcastle disease virus(NDV)modified SGC7901 cells, and explore a new therapeutic approach for gastric carcinoma. Methods Mononuclear cells were isolated from peripheral blood of healthy adults, and used for induction into dendritic cells (DC) and cytokine induced killer (CIK) cells. Gastric carcinoma antigen obtained through repeated freezing and thawing was used for pulsing DCs. The experiment included four experiment groups: CIK, DCCIK, CIK+NDV and DCCIK+NDV, and two control groups: target cell group(SGC7901) and effector cell group(CIK, NDV, DCCIK). The results were compared with the effects of chemotherapeutic agents (Fluorouracil, cisplatin) on SGC7901 cells. Results The cytotoxic activities of both CIK and DCCIK cells against SGC7901 cells were increased after antigen being modified by NDV. The cytotoxicity of DCCIK pulsed with gastric cancer cell antigen was the strongest (83.4%) with E∶T: 20∶1. The effect of chemotherapeutic agents, even after 48 hours of treatment, was less than that of CIK after 24 hours of treatment. Conclusion The cytotoxic activity of SGC7901pulsed DCCIK cells against NDV modified SGC7901 cells was the strongest. Biotherapy for stomach cancer was better than that of chemotherapy.

　　[KEY WORDS] stomach neoplasms; antigens, neoplasm; immunotherapy; dendritic cells; killer cells; newcastle disease virus

　　目前，胃癌仍采取以手术为主的综合治疗，疗效差。近年来细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)作为杀伤肿瘤的效应细胞引起了人们极大的关注[1]。此外树突状细胞(DC)是目前已知体内抗原递呈能力最强的抗原递呈细胞，具有独特的抗原提呈和激发功能，在肿瘤细胞和T淋巴细胞的相互作用中起桥梁和枢纽作用[2]。新城疫病毒(NDV)可通过多种机制作用于肿瘤细胞，其中之一是修饰肿瘤抗原，使肿瘤细胞隐含的抗原发生外露。本研究体外通过NDV使胃癌细胞SGC7901的抗原显露后，研究效应细胞(DCCIK)对胃癌细胞的杀伤作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　EPICS XL型流式细胞仪(美国COULTER公司)，17550型酶标仪(AUSTRLA)。基因重组人干扰素γ(IFNγ，购自上海生物制品所)，抗CD3单抗(购自武汉博士德生物公司)，重组人白细胞介素2(IL2，购自北京远策药业有限公司)，重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF，购自厦门特宝生物工程股份有限公司)，重组人白细胞介素4(rhIL4，购自北京军事医学科学院)，淋巴细胞分离液(Ficoll，购自中国医学科学院生物工程研究所)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 冻融法制备SGC7901细胞抗原 消化收集对数生长期的SGC7901细胞，用PBS液离心洗涤两次，再用PBS液重悬为1×1010/L，封装入冻存管。置液氮内冷冻10 min，取出后立即置37 ℃水浴10 min，重复3次。然后，以10 000 r/min离心30 min，取上清液-20 ℃保存备用。齐鲁医学杂志2010年10月第25卷第5期 Med J Qilu, October 2010, Vol.25, No.5

　　1.2.2 DC的诱导和扩增 取健康献血者50 mL肝素抗凝外周血用Ficoll密度梯度离心，分离单个核细胞。用含体积分数为0.10胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为2×109/L，然后以每孔1 mL加入24孔培养板中，置37 ℃、体积分数0.05 CO2恒温箱培养2 h。收集非黏附性细胞于50 mL离心管中，用于诱导CIK细胞。在留有贴壁细胞的24孔板中，每孔加入含有200 μg/L的rhGMCSF和106 U/L rhIL4的RPMI1640培养液1 mL，置于37 ℃、体积分数0.05 CO2条件下培养，每3 d半量换液，同时补足上述rhGMCSF及rhIL4。观察DC培养过程中的形态变化情况。

　　1.2.3 DC负载胃癌抗原 于DC培养第5天每孔加50 μL肿瘤抗原(胃癌细胞裂解液)，然后继续培养48 h。DC培养第6天加入TNFα(106 U/L)。

　　1.2.4 CIK细胞的诱导和扩增 将上述诱导DC时收集非贴壁细胞，用含体积分数0.10胎牛血清的RPMI1640培养液调细胞密度为3×108/L，同时将IFNγ(106 U/L)每孔1 mL加入24孔培养板中，置37 ℃、体积分数0.05 CO2恒温箱中培养24 h后再加入抗CD3Ab(25 mg/L)、IL2(109 U/L)。每3 d半量换液，同时补足抗CD3Ab及IL2。

　　1.2.5 DC和CIK细胞共培养 将培养7 d的经SGC7901细胞裂解液致敏的DC与部分CIK细胞以1∶3的比例混合，以CIK细胞培养液继续培养3 d后收集并计数CIK细胞。另一部分未与DC混合的CIK细胞也收集并计数。在DC及CIK细胞培养的第7天，采用流式细胞仪分析DC细胞表型CD86、CD83，CIK细胞表型CD16+56。

　　1.2.6 CIK细胞对SGC7901细胞的细胞毒作用及NDV的影响 CIK细胞收集前1 d，消化收集对数生长期的SGC7901细胞，RPMI1640培养液调密度为5×107/L，每孔100 μL加入96孔板，其中部分孔加入50 μL的NDV(1∶160)作用12 h后，收集经抗原、DC作用的CIK及未经抗原、DC作用的CIK。调密度为1.0×109/L、5.0×108/L，2.5×108/L，分别取100 μL加入盛有SGC7901细胞及经NDV作用的SGC7901细胞的培养孔中，使效靶比为5∶1、10∶1、20∶1，各设3个复孔，并设单纯各浓度CIK为效应细胞空白对照，NDV设单独对照。每孔用RPMI1640培养液补足至300 μL。培养12 h后，每孔加入MTT液(5 g/L)20 μL，再培养4 h，吸弃上清，每孔加入DMSO 100 μL，用酶标仪于570 nm处测吸光度(A)值，计算杀伤率。杀伤率=[1-(实验孔A值-效应细胞对照孔A值)/靶细胞对照孔A值]×100%。

　　1.2.7 化疗药对SGC7901细胞的杀伤作用 分别将氟尿嘧啶(5FU)、顺铂(DDP)加入装有SGC7901细胞(5×107/L)的96孔板中，调终浓度为5FU 5、10、20 mg/L，DDP 1.2 μg/L，5FU与DDP合用组浓度为5FU 10 mg/L、DDP 2 mg/L,各浓度设3个复孔。未与5FU、DDP作用的SGC7901细胞设为靶细胞空白对照孔，将每孔用RPMI1640培养液补至300 μL。共设2个96孔板，置37 ℃、体积分数0.05 CO2恒温箱作用24、48 h后分别测A值(方法同前)，计算杀伤率。杀伤率=(1-实验孔A值/靶细胞孔A值)×100%。

　　1.3 统计学处理

　　实验结果以±s表示，多组间比较采用方差分析[3]。

　　2 结 果

　　2.1 DC形态学观察

　　自外周血分离的单个核细胞(PBMC)呈球形，表面光滑。加入rhGMCSF和rhIL4培养2 d后，细胞体积增大，部分细胞形态不规则，呈梭形、多边形。培养4 d后，见部分细胞悬浮生长，部分细胞有毛刺伸出。培养7 d后大部分细胞聚集，胞体增大，见多数细胞有毛刺伸出。

　　2.2 DC及CIK细胞表型分析

　　培养第7天DC细胞的CD86、CD83表达增加,测CD83的表达率为 78.3%, CD86为 80.4%。培养第7天CIK细胞CD16+56的表达率为43.4%。

　　2.3 CIK及DCCIK细胞的细胞毒活性及NDV的影响

　　随着效靶比增加，CIK细胞对SGC7901细胞杀伤作用增强，效靶比20∶1时杀伤作用高于效靶比5∶1时(F=2 305.32,q=166.36,P<0.01)。在同一效靶比下，DCCIK组对SGC7901细胞的杀伤率则明显高于CIK组(F=2 103.22～5 168.41,q=21.354～326.23,P<0.01)。同时，NDV本身对SGC7901细胞也有杀伤作用，杀伤率在20%左右，但杀伤能力低于CIK组。用NDV修饰SGC7901细胞抗原后，无论是CIK细胞还是DCCIK细胞对SGC7901细胞的杀伤率均增加。其中负载胃癌细胞抗原的DCCIK细胞杀伤率最高，效靶比为20∶1时，达到83.4%。见表1。 齐鲁医学杂志2010年10月第25卷第5期 Med J Qilu, October 2010, Vol.25, No.5

　　2.4 化疗药对SGC7901细胞的杀伤作用

　　5FU、DDP在一定范围内，随浓度增加对SGC7901细胞杀伤作用而增强。将二者合用时对SGC7901细胞的杀伤有协同作用，明显增加杀伤效果。随杀伤时间延长，化疗药对SGC7901细胞的杀伤作用进一步增加，化疗药作用48 h与24 h的杀伤率比较，差异有统计学意义(t=4.60～37.18，P<0.05)。但48 h时化疗药物的疗效也不如单纯CIK细胞24 h的疗效。表1 CIK细胞对SGC7901细胞的杀伤率表2 24 h及48 h化疗药杀伤率

　　3 讨 论

　　肿瘤细胞表面存在肿瘤相关抗原，但这些抗原的免疫原性大多较弱或隐含，不足以引起宿主有效的抗肿瘤免疫反应，导致免疫逃逸。免疫治疗的关键是要充分显露肿瘤抗原，使肿瘤特异性杀伤细胞能在肿瘤细胞上辨认出更多抗原靶点，从而更有效地杀灭肿瘤细胞。本研究基于以上认识，既重视了肿瘤的杀伤手段，就是诱导、培养和扩增肿瘤特异性杀伤细胞，又注意了使肿瘤细胞隐含的抗原显露出来，使两方面结合提高杀伤效果。

　　CIK细胞是非MHC和非TCR限制性的细胞毒淋巴细胞，由外周血单个核细胞在多种细胞因子(如IFNγ、IL1、IL2、CD3Ab等)的共同刺激下诱导而成的[4]。CIK细胞表面既有T细胞表面标志(TCRα/β、CD3)，也有NK细胞的表面标志(CD56)。其细胞毒作用几乎惟一地存在于CD3+ CD56+细胞中。CIK细胞发挥抗肿瘤作用的机制可能是通过黏附因子与肿瘤细胞相互结合后，分泌含有大量BLT脂酶的细胞质颗粒，这些颗粒能够直接穿透封闭的靶细胞膜进行胞吐，从而导致肿瘤细胞的裂解。本研究显示，CIK细胞对SGC7901细胞有较强的杀伤作用，在效靶比为20∶1时杀伤率为46.4%，比化疗药(5FU、DDP)的作用效果好。

　　研究发现，DC、CIK细胞和某些抗原肽共同培养能产生多种生物学特性。①增殖活性高,在共培养过程中,DC、CIK两种细胞的数目显著增多,增殖速度甚至呈倍数增长;②细胞毒活性强，共培养的DCCIK细胞具有更高的肿瘤杀伤活性;③杀瘤谱广，共培养的DCCIK细胞对多种肿瘤具有杀伤活性。因此，可增强对某些缺乏特异性抗原的肿瘤细胞的杀伤能力。LINN等[5]研究也证实，共培养DC、CIK能在低效靶比条件下清除大量肿瘤细胞。本研究用反复冻融法来提取胃癌细胞(SGC7901)的肿瘤相关抗原，然后用它致敏DC细胞，用于诱导特异性CIK细胞杀伤胃癌细胞，结果负载SGC7901胃癌细胞抗原的DCCIK细胞对胃癌细胞的杀伤作用明显强于单纯CIK治疗组(P<0.01)，显示出识别多克隆抗原的CIK细胞对SGC7901胃癌细胞的杀伤效果较好。

　　目前的研究报道，多数只注意了杀伤手段的开发研究，如何能使有效的杀伤细胞有的放矢，成为关键问题。研究结果表明，NDV是副黏病毒科腮腺炎病毒属的成员,其具有修饰肿瘤细胞抗原的作用，在人类癌细胞内的复制比在正常细胞内复制高10 000倍[6]，能够选择性杀伤人肿瘤细胞,其与肿瘤细胞的结合是特异和不可逆的，而对人正常细胞无明显影响[7]。VOLKER[8]研究表明， 用类似人体抵抗病毒感染的机制，将肿瘤细胞体外培养，用NDV修饰抗原使其外露，使肿瘤细胞的抗原性增强，然后灭活肿瘤细胞，回输肿瘤病人，即用NDV修饰的自体肿瘤疫苗(NDVATV)进行主动特异性免疫治疗，具有明显的效果，与肿瘤病人的常规治疗的效果比较，能够明显延长病人的生存期。本研究利用NDV能增加肿瘤的免疫原性这一特点，让体外扩增的特异性CIK细胞有的放矢，有针对性地杀伤胃癌细胞。结果显示，NDV本身对SGC7901胃癌细胞具有杀伤性，但同CIK细胞及DCCIK细胞相比较，其杀伤力较弱。用NDV修饰胃癌细胞抗原后，再用特异性DCCIK细胞进行杀伤，取得了前所未有的治疗效果，杀伤率达到83.4%。该研究作为一种新方法，为胃癌的生物治疗奠定了实验基础。

　　研究发现，CIK细胞在体外培养15 d左右临床应用的量和效力比率最合适。本研究因实验条件所限，使用培养第9天的DCCIK就达到了如此的疗效，显示出用特异性DCCIK杀伤经NDV修饰抗原的胃癌细胞方法的有效性。CIK细胞是目前较理想的肿瘤杀伤细胞，用于临床肿瘤治疗前景广阔。

【参考文献】
  　[1]于津浦,任秀宝. CIK细胞——肿瘤过激免疫治疗的新希望[J]. 中国肿瘤临床, 2001,28(7):557560.

　　[2]李金凤,张震宇. 卵巢癌细胞和脐血树突状细胞融合瘤苗抗肿瘤免疫效应的初步研究[J]. 中国肿瘤临床, 2007,37(14):789793.[3]周晓彬,纪新强,徐莉. PPSM 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):9193.

　　[4]NAGARAJ S, ZISKE C, SCHMIDTWOLF I G. Human cytokine  induced killer cells have enhanced in vitro cytolytic activity via nonviral interleukin2 gene transfer[J]. Genet Vaccines Ther, 2004,2(1):12.

　　[5]LINN Y C, HUI K M. Cytokine induced killer cells: NK Like T cells with cytotolytic specificity against leukemia[J]. Leuk Lymphoma, 2003,44(9):14571462.

　　[6]PECORAAL, RIZVI N, COHEN G I, et al. Phase Ⅰ trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, patients with advanced solid cancers[J]. J Clin Oncoll, 2002,20:22512266.

　　[7]BIAN H, FOURNI P, MOORMANN R, et al. Selective gene transter in vitro to tumor cells via yecombinant Newcastle disease virus [J]. Cancer Gene Ther, 2005,12(3):295303.

　　[8]VOLKER S. Clinical trials of antitumor vaccination with an autologous tumor cellvaccine modified by virus infection: improvement of patient survivalbased on improved antitumor immune memory[J]. Cancer Immunol Immunother, 2005,54:587598.