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【摘要】 目的探讨兔脑缺血再灌注后细胞凋亡和基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)表达的特点。方法成年健康新西兰兔103只，应用线栓法建立大脑中动脉闭塞(MCAO)动物模型，将成功的60只兔MCAO模型随机分为永久性缺血组和缺血再灌注组，各30只。原位末端标记法检测两组脑组织细胞凋亡的情况，免疫组织化学方法检测脑组织TIMP-1表达的情况。结果脑缺血后脑组织细胞凋亡数逐渐增多，缺血12 h达高峰，以后逐渐减少(F=14.48，q=4.79~9.39，P<0.01)。缺血1 h时脑组织TIMP-1阳性细胞数逐渐增多，48 h达高峰(F=52.05，q=4.98~19.43，P<0.01)。动物缺血1 h再灌注后，各时间点凋亡细胞数和TIMP-1表达都低于永久性缺血组，再灌注23 h阳性细胞数最多，再灌注47 h下降(F=8.34、53.34，q=3.10~18.70，P<0.01)。结论急性脑缺血再灌注后，细胞凋亡与TIMP-1表达一致。
【关键词】 再灌注损伤;细胞凋亡;基质金属蛋白酶抑制因子;兔
ObjectiveTo study the characteristics of apoptosis and expression of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) in rabbits after cerebral ischemia and reperfusion.MethodsA total of 103 adult healthy New Zealand rabbits were used for the study. A model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) was successfully created in 60 rabbits with filament ligation method, which were equally randomized to permanent ischemia (PI) group and ischemia-reperfusion (IR) group. The tissue apoptosis was determined with TUNEL assay and immunohistochemisty used to tdetect the expression of TIMP-1 in cerebral tissue.ResultsAfter cerebral ischemia, the number of apoptotic cells increased gradually and reached the peak at 12 h, and then the number began to decrease gradually (F=14.48,q=4.79-9.39,P<0.01). The expression of TIMP-1 enhanced 1 h after ischemia, reaching the peak at 48 h (F=52.05,q=4.98-19.43,P<0.01). The number of cell apoptosis (F=8.34,q=3.10-7.36,P<0.01) and TIMP-1 expression (F=53.34,q=6.47-18.70,P<0.01) in those reperfusion after ischemia for 1 h were significantly lower at all time points than that in PI group. The number of cells reached the greatest level 23 h after reperfusion, and then began to decrease at 47 h.ConclusionThe expression of TIMP-1 was in accordance with cell apoptosis after acute ischemia-reperfusion.
[KEY WORDS]reperfusion injury; apoptosis; tissue inhibitor of metalloproteinase; rabbits
脑缺血再灌注可因损伤血-脑脊液屏障(BBB)引起血管源性脑水肿，甚至脑疝的发生，增加急性期脑梗死病人的病死率[1]。近年研究结果显示，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在缺血早期BBB损害中起重要作用，基质金属蛋白酶抑制因子-1 (TIMP-1) 是MMP-9的内源性抑制剂，TIMP-1与MMP-9表达的变化对BBB的完整性起重要作用[2-3]。本研究为了探讨急性脑缺血再灌注后不同时期脑组织细胞凋亡和TIMP-1表达的变化规律，分别采用原位末端标记法和免疫组化法对细胞凋亡和TIMP-1表达进行了检测。现将结果报告如下。
1材料与方法
1.1模型建立
成年健康新西兰兔103只，雌雄不限，体质量2.3~3.3 kg，SPF级，由山东省农业科学院实验动物中心提供(SCX20040013)。动物均于实验前置于实验室适应环境1周，自由进食、饮水;室温(23±2)℃，自然光照，术前禁食12 h。随机选择10只作为假手术组，其余动物应用线栓法建立大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。术中保持肛温37 ℃。顺利完成插线后1 h经磁共振成像(MRI)检查DWI像出现片状高信号区者为模型制作成功[4]。将60只成功的动物模型随机分为永久性缺血(I)组和缺血再灌注(R)组各30只。其中，I组再分为I1~I6组，即缺血1、3、6、12、24和48 h组，每组5只;R组再分为R1~R6组，即缺血1 h再灌注0、2、5、11、23和47 h组。
1.2石蜡切片制备
各组动物在相应时间点以100 g/L水合氯醛0.3 mL腹腔注射麻醉后，依次用生理盐水、40 g/L甲醛溶液各200 mL经心脏灌注固定后断头取脑，置于40 g/L甲醛溶液后固定2 h，蒸馏水浸泡4 h。常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。自视交叉后方开始连续冠状位切片，厚度7 μm，贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上，4 ℃保存备用。
1.3细胞凋亡检测
采用原位末端标记法(TUNEL)，细胞凋亡试剂由武汉博士德生物工程有限公司提供。严格按照说明书上的步骤进行操作，显微镜下观察阳性细胞为棕黄色时终止反应，阴性对照切片不加探针，用浓度0.01 mol/L的PBS代替，不出现阳性反应。光镜下观察皮质和纹状体区的阳性细胞数，各取4个高倍视野(400倍)计数细胞。
1.4免疫组化检测
兔抗兔TIMP-1单克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒、DAB染液均购于武汉博士德生物工程有限公司。严格按说明书染色步骤操作。光镜下观察胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞。阴性对照切片不加一抗，用0.01 mol/L的PBS代替，不出现阳性反应。每只动物取4张连续切片，在光镜下观察皮质和纹状体区的阳性细胞数，各取4个高倍视野(400倍)计数细胞。
1.5统计学处理
数据均采用SPSS 13.0及PPMS 1.5[5]统计软件处理。
2结果
各组皮质区和纹状体区凋亡细胞数和TIMP-1阳性细胞数差异无显著性，故合并统计。
2.1I组细胞凋亡数与TIMP-1阳性细胞数
动物在缺血1 h即出现凋亡细胞，而且随时间延长阳性细胞数逐渐增多，缺血12 h阳性细胞数达高峰，以后阳性细胞数又逐渐减少(F=14.48，q=4.79~9.39，P<0.01)。缺血1 h时，TIMP-1即开始表达，阳性细胞数明显增加，随时间延长TIMP-1表达增多，到缺血48 h时达高峰(F=52.05，q=4.98~19.43，P<0.01)。见表1。
2.2R组细胞凋亡数与TIMP-1阳性细胞数
动物缺血1 h再灌注后，凋亡细胞数缓慢上升，再灌注23 h平均凋亡细胞数最多，再灌注47 h凋亡细胞数下降(F=8.34，q=3.10~7.36，P<0.01)，各时间点凋亡细胞总数均呈低于永久缺血组的趋势。动物缺血1 h再灌注2 h后TIMP-1表达增多，再灌注23 h达高峰(F=53.34，q=6.47~18.70，P<0.01)，但表达程度呈低于永久缺血组的趋势。见表2。表1I组细胞凋亡数和TIMP-1阳性细胞数表2R组细胞凋亡数和TIMP-1阳性细胞数
3讨论
MMP-9是基质金属蛋白酶家族中的重要成员之一，激活时能降解参与BBB基膜的主要成分Ⅳ型胶原、层粘蛋白和纤粘蛋白等，过度表达的MMP-9可破坏血管基底膜，引起BBB的通透性升高，导致血管源性水肿、血循环中炎性细胞渗入及继发出血等[6]。TIMP-1是MMP-9的内源性抑制剂，由结缔组织细胞和巨噬细胞产生，同时多种细胞因子能诱导其分泌。它主要通过酶原活化阶段与proMMP-9形成稳定的复合物来阻碍酶原的自我激活，同时MMP-9活化后与TIMP-1以1∶1非共价键形成MMP-TIMP复合体，阻断MMP-9与底物结合而发挥作用[7]。二者在缺血早期逐渐增多，再灌注24~48 h达高峰，随着再灌注时间延长至第5天BBB关闭，表达显著降低，表明与BBB破坏有关[8]。
BBB完整性破坏是脑缺血再灌注后脑水肿、炎性细胞浸润，进而导致神经细胞死亡的重要原因[9]。ROSENBERG等[10]研究显示，在缺血再灌注3和48 h BBB通透性明显增加，其中48 h通透性最大，同时发现TIMP-1也在48 h达最大量，且TIMP-1表达与MMP-9同步升高，提示TIMP-1可能抑制或削弱MMP-9的作用。本文研究结果显示，R组23 hTIMP-1表达达高峰，这与缺血再灌注BBB第2次开放时间相一致，而有研究结果显示此开放与MMP-9参与对BBB的破坏有关[11]。
本文研究显示，随着脑缺血时间延长，脑组织凋亡阳性细胞数逐渐增多，缺血12 h阳性细胞数达高峰，以后阳性细胞数又逐渐减少，而TIMP-1到缺血48 h时达高峰，提示缺血诱导细胞凋亡，继而引发TIMP-1表达，对抗MMP-9等炎性因子导致的细胞凋亡。缺血1 h再灌注后，凋亡细胞数缓慢上升，再灌注23 h平均凋亡细胞数和TIMP-1阳性细胞最多，再灌注47 h凋亡细胞数下降，各时间点凋亡细胞总数均呈低于永久缺血组的趋势。提示再灌注恢复血液供应后，在一定程度上能减轻脑组织损伤。
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