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【摘要】 目的观察β1整合素表达下调对人结肠癌HT-29细胞增殖和化疗敏感性的影响。方法采用反义寡核苷酸(ASODN)技术转染HT-29细胞，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测β1整合素表达下调情况。MTT法检测HT-29细胞相对存活率。给予梯度浓度氟尿嘧啶(5-FU)，计算IC50。结果实验组β1整合素条带吸光度积分(IAD)值/β-actin条带IAD值的比值及HT-29细胞的存活率与对照组相比显著降低(F=1 630.08,q=72.40,P<0.01;t=4.37,P<0.05)。5-FU+ASODN组HT-29细胞对5-FU的IC50与5-FU组比较显著下降(t′=37.71,P<0.05)。结论β1整合素表达下调可抑制结肠癌细胞增殖，增强结肠癌细胞对化疗药物敏感性。
【关键词】 结肠肿瘤;抗原,CD29;细胞增殖;药物筛选试验,抗肿瘤
ObjectiveTo investigate the effect of down-regulation of integrin-β1 expression on cell proliferation and chemosensitivity of human colon cancer cell line HT-29.MethodsHT-29 cells were transfected with antisense oligonucleotide technology, the down-regulation of integrin-β1 mRNA expression was detected by RT-PCR. The relative survival rate of HT-29 cells was determined by MTT method. Gradient concentrations of 5-fluorouracil (5-FU) were given, and IC50 calculated.ResultsIn comparison with the control group, the expression of integrin-β1 mRNA of HT-29 cells in the experimental group was markedly down-regulated (F=1 630.08,q=72.40,P<0.01), and the survival rate of HT-29 cells was significantly reduced (t=4.37,P<0.05), and the IC50 remarkably decreased (t′=37.71,P<0.05).ConclusionDown-regulation of integrin-β1 can effectively inhibit cell proliferation and enhance the sensitivity of human colon cancer cell to chemotherapeutics.
[KEY WORDS]colonic neoplasms; antigens, CD29; cell proliferation; drug screening assays, antitumor
结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年增高。肝转移是影响结直肠癌预后的重要因素，无法切除肝转移灶病人的中位生存期仅6.9个月[1]。目前，手术仍是惟一有效的治愈手段，但仅有10%病人适合于手术切除。现有的化疗药物大多疗效欠佳，因此降低药物副作用、增强化疗敏感性已成为目前结肠癌治疗的研究热点。整合素主要介导细胞与细胞外基质(ECM)的黏附，是一类最重要的细胞黏附分子。整合素还介导细胞间的黏附，参与细胞多种生理功能和病理变化。谭晓杰等[2]研究显示，β1整合素反义寡核苷酸(ASODN)通过降低β1整合素表达，对人结肠癌HT-29细胞体外侵袭具有抑制作用。本实验采用ASODN技术使人结肠癌HT-29细胞β1整合素表达下调，观察β1整合素表达下调对HT-29细胞增殖和对化疗药物敏感性的影响。
1资料与方法
1.1细胞培养
人结肠癌细胞株HT-29购于武汉同济医院。将细胞接种于含体积分数0.10小牛血清的RPMI 1640培养液(Gibco公司)中，在37 ℃、95%湿度及体积分数0.05 CO2的培养箱中培养，每48 h胰酶消化传代1次，实验所用细胞均处于对数生长期。
1.2ASODN技术
β1整合素ASODN序列为:5′-T*G*CAGTAAGCATCCAT*G*T-3′，无义寡核苷酸(NSODN)序列为：5′-G*C*AACGAGAGAGCCGT*C*G-3′,*为硫代位点，由大连宝生物公司合成。实验分3组：实验组(以脂质体转染ASODN)、NSODN组(以脂质体转染NSODN)和对照组(未转染)。在聚苯乙烯管中以无血清RPMI 1640培养液分别稀释ASODN、NSODN和LIPOFECTAMINE 2000脂质体，ASODN及NSODN浓度均为120 mg/L，LIPOFECTAMINE 2000脂质体终浓度为10 mg/L。分别将两管稀释液轻轻混匀以便形成寡核苷酸-脂质体复合物，于室温下放置40 min。取对数生长期的HT-29细胞，使用无血清的RPMI 1640培养液洗1次，然后缓慢加入寡核苷酸-脂质体复合物，置于37 ℃、95%湿度及体积分数0.05 CO2的培养箱中培养6 h，弃去转染液，换含体积分数0.20胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养48 h。
1.3RT-PCR检测β1整合素mRNA的表达
采用TriZOL总RNA纯化试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取总RNA，用逆转录酶和oligo(dT)按37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min条件进行cDNA 的合成。取1 μL逆转录产物进行PCR扩增，反应条件为：95 ℃变性5 min，95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，32个循环，72 ℃延伸10 min。反应体系以β-actin作为内参照。β1整合素上游引物：5′-AA- TGAAGGGCGTGTTGGTAG-3′;下游引物：5′-CT-GCCAGTGTAGTTGGGGTT-3′，扩增产物长290 bp。β-actin上游引物：5′-GGGACCTGACTGACTACC-TC-3′;下游引物：5′-ACTCGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′，扩增产物长546 bp，上述引物均由大连宝生物公司合成。
1.4MTT法检测细胞存活率
单细胞悬液以每孔1×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100 μL。培养24 h后，以无血清RPMI 1640培养液洗1次，缓慢加入寡核苷酸和脂质体复合物，在37 ℃、95%湿度及体积分数0.05 CO2 的培养箱中培养6 h，弃去转染液，换含体积分数0.10小牛血清的RPMI 1640培养液继续培养。于转染后72 h用MTT法在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(A)值，计算细胞存活率。细胞存活率=实验孔A值/对照孔A值×100%。实验重复4次，取其均值。
1.5β1整合素表达下调对化疗敏感性的影响
HT-29细胞接种于96孔板，按处理方法分为氟尿嘧啶(5-FU)组和5-FU+ASODN组。转染24 h后两组细胞均加入梯度浓度的5-FU(25、50、100、200 mg/L)，继续培养48 h。以Prism 3软件计算化疗药物的IC50。
1.6统计学分析
采用SPSS 11.5软件进行t检验和方差分析。
2结果
2.1HT-29细胞β1整合素mRNA的表达
如图1所示，实验组β1整合素条带吸光度积分(IAD)值/β-actin条带IAD值的比值(0.221±0.011)与对照组(0.954±0.025)比较，差异有统计学意义(F=1 630.08，q=72.40，P<0.01);而NSODN组(0.901±0.022)与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2β1整合素表达下调对HT-29细胞存活率影响
对照组HT-29细胞存活率为100%，NSODN组为(92.90±4.32)%，两组比较差异无显著性(P>0.05);实验组HT-29细胞的存活率为(61.10±1.78)%，较以照组显著降低(t=4.37，P<0.05)。
2.3β1整合素表达下调对HT-29细胞化疗敏感性的影响
5-FU+ASODN组HT-29细胞对5-FU的IC50为(31.45±0.79)mg/L，低于5-FU组的(126.53±4.98) mg/L，差异有显著性(t′=37.71，P<0.05)。A：Marker DL2000;B：对照组;C：NSODN组;D：实验组。图1人结肠癌HT-29细胞β1整合素mRNA的表达
3讨论
整合素是由α和β两个亚基组成的异二聚体，β亚基的胞浆区含有Asp-X-Sev-X-Sev 序列，参与细胞骨架蛋白的相互作用和胞内信号传导。整合素将胞外的ECM 分子与细胞内的骨架蛋白连接起来形成焦点黏附物。焦点黏附物是整合素内外双向信号传导的结构基础，许多信号蛋白通过与焦点黏附物结合，调节细胞凋亡、增殖、迁移和黏附[3]。整合素与肿瘤细胞的凋亡及耐药具有密切关系。JOHNSTONE 等[4]认为，肿瘤细胞产生耐药的关键因素之一是肿瘤细胞凋亡机制缺陷。FORNARO等[5]研究结果显示，β1整合素与ECM配体结合后，通过PKB/AKT途径使Survivin的表达上调，对肿瘤坏死因子-α诱导的前列腺癌细胞凋亡具有抑制作用。MATTER等[6]研究显示，αvβ3、α5β1整合素与ECM中的相应配体(玻璃黏连蛋白、纤连蛋白)结合后可激活FAK和Shc，通过黏着斑蛋白激酶(KAK)依赖的Ras信号系统激活PI-3K/AKT，从而提高bcl-2的转录水平，使细胞的凋亡受到抑制。AOUDJIT等[7]研究显示，在MDA-MB-231 和 MDA-MB-435乳癌细胞中，β1整合素与ECM配体结合，通过激活PI-3K/AKT信号传导通路，抑制线粒体释放细胞色素C，对抗紫杉醇和长春新碱等化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡。以上研究结果提示，调控整合素的表达可能诱导肿瘤细胞凋亡和逆转耐药的发生。
ASODN技术[8]是将与靶基因序列互补的小分子寡核苷酸导入细胞，通过激活核酶RNaseH等机制，促使mRNA降解，抑制转录过程，从而抑制编码蛋白的表达。
本实验采用ASODN技术使人结肠癌HT-29细胞β1整合素表达下调，其结果显示实验组HT-29细胞存活率显著降低(P<0.05)，而NSODN对HT-29细胞生长无明显影响。提示下调β1整合素表达具有抑制HT-29细胞增殖的作用。然而，肿瘤的发生发展是一个多基因变异累积的过程，单一下调某种靶基因不可能有效地抑制肿瘤进展。多项研究证明，ASODN与化疗药物联合应用可产生更强的抗肿瘤效应[9]。
本实验采用ASODN技术使人结肠癌HT-29细胞β1整合素表达下调，加入梯度浓度的化疗药物5-FU，研究结果显示5-FU+ASODN组的HT-29细胞对5-FU的IC50明显低于5-FU组。β1整合素表达下调，可能通过诱导凋亡抑制HT-29细胞的生长，同时增强了HT-29细胞对化疗药5-FU的敏感性，其具体的机制有待进一步探讨。
本研究结果提示，β1整合素表达下调能明显抑制HT-29细胞的增殖，联合应用化疗药物，可降低化疗药剂量，减少其副作用，并增强癌细胞对化疗的敏感性。
【参考文献】
\[1\]SADAHIRO S, SUZUKI T, ISHIKAWA K, et al. Recurrence patterns after curative resection of colorectal cancer in patients followed for a minimum of ten years\[J\]. Hepatogastroenterology, 2003,50(53):1362-1366.
\[2\]谭晓杰,张建立,高军. β1整合素反义寡核苷酸对人结肠癌细胞黏附和侵袭抑制作用\[J\]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(4):286-288.
\[3\]YAMADA K M, GEIGER B. Molecular interactions in cell adhesion complexes\[J\]. Cur Opin Cell Biol, 1997,9(1):76-85.
\[4\]JOHNSTONE R W, RUEFLI A A, LOWE S W. Apoptosis: a link between cancer genetics and chemotherapy\[J\]. Cell, 2002,108:153-164.
\[5\]FORNARO M, PLESCIA J, CHHEANG S, et al. Fibronectin protects prostate cancer cells from tumor necrosis factor-α-induced apoptosis via the AKT/Survivin pathway\[J\]. J Biol Chem, 2003,278(50): 50402-50411.
\[6\]MATTER M L, RUOSLAHTI E. A signaling pathway from the alpha5beta1 and alpha(v)beta3 integrins that elevates bcl-2 transcription\[J\]. J Biol Chem, 2001,276:27757-27763.
\[7\]AOUDJIT F, VUORI K. Integrin signaling inhibits paclitaxel-induced apoptosis in breast cancer cells\[J\]. Oncogene, 2001,20:4995-5004.
\[8\]DIAS N, STEIN C A. Antisense Oligonucleotides: basic concepts and mechanisms\[J\]. Mol Cancer Ther, 2002,1:347-355.
\[9\]GLEAVE M, CHI K N. Knock-down of the cytoprotective gene, clusterin, to enhance hormone and chemosensitivity in prostate and other cancers\[J\]. Ann N Y Acad Sci, 2005,1058:1-15.