肺心病患者红细胞蛋白激酶C活性表达的研究

   【摘要】 目的 探讨蛋白激酶C（PKC）与肺心病发病的关系。方法 测定40例肺心病（CP）患者、40例正常对照（NC）者的红细胞胞膜、胞浆蛋白激酶C（PKC）活性。结果 肺心病患者红细胞膜中PKC活性显著高于正常对照者，且差异具有显著性，P<0.01;肺心病患者红胞浆中PKC活性显著高于正常对照者，且差异具有显著性，P<0.01。结论 PKC可能与肺心病的发病有关。

关键词 蛋白激酶C 肺心病 红细胞

Clinical study of protein kinase C activity in erythrocytes

from cor pulmonale patients

Wang Hongxia，Wang Qian

Department of Respiration，Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College，Shenyang110024.

【Abstract】 Objective To explore the relationship between protein kinase C（PKC）and cor pulmonale（CP）.Methods We measured the acitivity of protein kinaseC（PKC）in membrane and cytosol of erythrocytes in40cor pulmonale（CP）patientsand40normal control（NC）.Results The activity of PKC in membrane of erythrocytes in CP was higher than in NC.The difference was statistically significant（P<0.01）;The activity of PKC in cytosol of erythrocyte in CP was higher than in NC，the difference was statistically significant（P<0.01）.Conclusion protein kinaseC（PKC）is likely associated with the cor pulmonale patients.

Key words protein kinase C cor pulmonale erythrocyte

蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）是一种独特的Ca ²⁺ 激活、磷脂依赖性的蛋白激酶，PKC通过对蛋白质的磷酸化而发挥其生理作用。PKC的功能极其多样化。其参与分泌、细胞膜脱颗粒、离子通道调节、受体与信号转导装置的相互作用的调节、平滑肌收缩、基因表达与细胞增生等一系列与生命现象密切相关的过程 ^［1］ 。近年来PKC在肺动脉高压形成中的病理作用也渐受重视。本研究通过测定肺心病患者红细胞胞膜、胞浆PKC的活性表达探讨肺动脉高压时PKC活性改变，以初步探讨PKC与肺心病发病的关系。

1 资料与方法

1.1 对象选择

1.1.1 CP组 40例，男24例，女16例，年龄（51.70±8.62）岁（40～60岁）。临床症状、心电图、胸部X线等符合1977年我国修订的慢性肺心病的诊断标准。

1.1.2 NC组 40例，男25例，女15例，年龄（50.86±8.36）岁（40～62岁）。无心肺疾患、系统检查无异常的相对健康者。所有病例均除外血液病、肝肾疾病、糖尿病、高血压病、脑血管疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 试剂 组蛋白（HistoneⅢ—S）、磷脂酰丝氨酸（PS）、甘油二酯（DG）均购自Sigma公司。［γ- 32 P］ATP（10mCi/ml）购自北京亚辉公司。

1.2.2 实验仪器 低温高（低）速离心机、超声波细胞粉碎仪、磁力搅拌器、BECKMAN液体闪烁计数仪、岛津UX—260记录式分光光度计等。

1.2.3 实验方法

1.2.3.1 PKC样品制备 受检者于晨起空腹取静脉血10ml，抗凝处理。常规分离出压积红细胞。实验取压积红细胞，分别加入BufferA（含2mmol/L EDTA、10mmol/L EGTA、20mmol/LTris/HCl、0.25mol/L蔗糖），-4℃超声粉碎，100000×g，4℃离心60min，取上清装入DEAE纤维素柱中，BufferB洗涤后（含2mmol/L EDTA、5mmol/L EGTA、50mmol/L2-ME、20mmol/LTris/HCL），用含0.1mol/L的BufferB洗涤，收集洗脱液进行活性测定。取沉淀物（RBC膜）加入膜蛋白提取液（含1%TrttonX—100、5mmol/L EGTA、2mmol/L ED_ˉTA），超声粉碎，100000×g，4℃离心60min，取上清过柱（步骤同胞浆过柱），收集洗脱液进行活性测定。

1.2.3.2 PKC活性测定 以组蛋白为底物，反应总体积为50μl。反应混合液含0.5mol/L Tris/HCl、pH7.5、25mmol/L醋酸镁（MgAc）、12.5mmol/L氯化钙（CaCl ₂ ）、0.1%磷脂酰丝氨酸（PS）、0.5%Ⅲ-S型组蛋白（HistoneⅢ-S）、0.25mmol/L Cold ATP。反应以加入［γ- 32 P］ATP开始，反应在Eptube（0.5ml试管）中进行，30℃反应7min。立即取反应液25μl点于Plusphocellulose（whatmanP ₃₁ 强阳离子交换体）上。样品点上后马上浸于75mmol/L磷酸液中，磁力搅拌器不断搅拌，洗3次，每次2min。将滤纸取出、烤干，放入有10ml蒸馏水的闪烁瓶中，BECKHTMAN液体闪烁计数仪测定放射活性（cpm数）。酶比活性表示为30℃时每毫克蛋白质每分钟催化多少pmolγ- 32 P掺入底物蛋白（pmol/mg/min）。

1.2.4 统计学处理 数据以均值±标准差（^ˉx±s）表示，组间比较采取t检验，P<0.05为差异有显著性。

2 结果

（1）CP组红细胞胞膜PKC的比活性明显高于NC组，CP组是NC组的1.42倍，差异具有显著性（P<0.01）。实验数据见表1。（2）CP组红细胞浆中PKC的比活性明显高于NC组，CP组是NC组的1.22倍，且差异具有显著性（P<0.01）。实验数据见表1。

表1 二组受检者红细胞的PKC比活性

注:与NC组比较: ˇ P<0.01

3 讨论

肺心病是一种危害人类健康的常见病，慢性低氧性肺动脉高压的发病机制虽经长期大量研究，仍不很清楚。但先决条件是肺的功能和结构的不可逆性改变，发生反复的气道感染和低氧血症。导致一系列的体液因子和血管的变化，使血管阻力增加，肺动脉血管的结构重构，产生肺动脉高压。随着对低氧性肺动脉高压研究的深入，肺血管重构在低氧性肺动脉高压中的作用日益受到重视。PKC是细胞膜后最重要的信号传导途径之一。研究表明，它在低氧性肺动脉高压发病的多个环节中起重要的介导作用 ^［2，3］ 。

蛋白激酶（PKC）是一种独特的磷脂依赖性、Ca ²⁺ 激活的蛋白激酶。它广泛传递多种细胞外信息通过细胞膜，调节细胞内许多依赖于Ca ²⁺ 的代谢过程。无论是在细胞释放、溶解、膜运输、受体的增效与去敏、平滑肌的收缩，还是在调控细胞分化、增殖、癌变的过程中都起着关键性的作用 ^［4，5］ 。1985年Palfrey和Waseem报道人红细胞会有钙和磷脂酰丝氨酸依赖的蛋白激酶C（PKC）。Ramachadran采用（ ³ H）标记的二丁酰佛波脂（PDBU）作为配基，发现正常人红细胞含有配基特异性结合的受体，即PKC ^［6］ 。

本研究发现肺心病患者红细胞胞膜、胞浆PKC活性高于正常对照组，即红细胞PKC的总体水平增高，这说明存 在着PKC活性的重新分布，发生了PKC的膜转移。Nishizu_ˉka提出，各种细胞外信号如激素、神经介质都通过两条途径来完成其细胞反应，即PKC激活和钙动点 ^［5］ 。在静息状态下，细胞中PKC以无活性、可溶性状态存在于胞浆中，在生物信息刺激下，胞外信使作用于膜相应受体，通过G-蛋白激活磷脂酶C，肌醇磷脂（PIP ₂ ）被磷脂酶C特异水解，生成甘油二酯（DG）和三磷酸肌醇（IP ₃ ）。DG激活PKC使细胞内蛋白发生磷酸化，IP ₃ 介导了Ca ²⁺ 动员，使胞浆Ca ²⁺ 浓度升高。DG和IP ₃ 目前已被认为是两种新的第二信使，它们广泛参与调控细胞的代谢过程。在酶活化过程中，PKC从胞浆移至胞膜，成为膜结合的PKC，因此一般以胞膜PKC作为酶活性的标志 ^［7］ 。PKC从胞浆移至细胞膜上是生物信息传递的最重要事件。有研究表明，慢性低氧者肺组织PKC活性升高，提示PKC的活化和高表达可能在低氧性肺动脉高压的形成和发展中有重要的作用。

参考文献

1 Koya D，King GL.Protein Kinase C activation and the development of diabetic.Science，1986，233:305.

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