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关键词 结核分支杆菌 rPOB基因 KatG基因 药物耐受性
近年来，全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药（DR-TB）和耐多药（MDR-TB）结核病的广泛分布和迅速传播。作为一线抗结核药物，INH、RFP结核病的预防、治疗方法起着重要作用。但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。国内外已有报道RFP和INH耐药性的产生是由于rpoB基因和KatG基因突变所致 ［1，2］ 。而用PCR-SSCP方法直接检测临床标本则少有报道。我们采用PCR-SSCP银染法直接检测临床标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 H37RV标准株来源于中国药品生物制品检定所，98例肺结核病人根据临床症状、涂片结果、胸部X线和培养结果确诊，并按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌，其中63例耐RFP，35例耐INH。20例非结核肺部疾病组包括肺炎、支气管炎、肺癌等。两组病人均来自太原市结核病医院、吉林市结核病防治研究所和解放军三零九医院。
1.2 引物 分别由上海生工和中科院微生物所合成。序列为rPOB15′CGGATGACCACCCAGGAC，rPOB25′GGTTTCˉGATCGGCACAT，KatG15′GCGATCACTACCGTGATCACA，KatG25′GTCAGGGCGTCAAGTCGACTG。
1.3 方法
1.3.1 痰标本中DNA的提取 取晨痰加1～2倍体积TE和50～100μl消化液，80℃浴30～60min，其间振荡数次，静置，取上清提到DNA。用解放军三零九医院结研室研制的PCR前处理前试剂盒提取。
1.3.2 PCR扩增 采用25μl反应体系，4×dNTPs终浓度为0.2mmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，扩增程序为94℃变性1min，61℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸10min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳。紫外检测rPOB出现258bp条带，KatG出现282bp条带即为扩增阳性。
1.3.3 SSCP银染 PCR扩增阳性的标本进行SSCP检测，扩增产物加等量甲酰胺变性液95℃变性10min，立即冰浴5min，在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，条件为6℃，电压100V，电泳约2～3h，电泳结束后，取凝胶板行硝酸银染色，观察结果并照相。
2 结果
2.1 肺结核病人痰标本中结核分支杆菌rpoB基因突变的结果 63例耐RFP痰标本第1次扩增有45例扩增阳性，2次扩增后又有12例阳性，6例仍为有阴性。PCR-SSCP分析rpoB基因突变，57例扩增阳性痰标本中有46例SSCP图谱与标准株H37Rv有差异，阳性率为65.2%。
2.2 肺结核病人痰标本中结核分支杆菌KatG基因突变的结果 35例耐INH痰标本第1次扩增有15例扩增阳性，2次扩增后又有5例阳性，10例仍为阴性。PCR-SSCP分析KatG基因突变，20例扩增阳性痰标本中有15例SSCP图谱与标准株H37Rv有差异，阳性率为42.8%。
2.3 20例非结核肺部疾病组检测rpoB和KatG基因扩增均为阴性 见表1。
表1 痰标本结核分支杆菌
注: ˇ SSCP图谱与H37RV有差异，“/”号为未做
3 讨论
目前，结核分支杆菌耐药性测定仍多采用绝对浓度法、比例法等经典方法。但由于结核分支杆菌生长缓慢，而耐药结核分支杆菌生长更为缓慢，其耐药性测定需6～8周甚至更长，不能及时指导临床用药。Bactec结核培养系统因其价格昂贵等诸多不便限制了其广泛使用。近年来，随着分子生物学的不断发展已研究发现结核分支杆菌耐RFP与其核心区域rpoB基因突变有关。结核分支杆菌耐INH与KatG基因突变有关。PCR-SSCP是一种检测基因突变简便、快速的方法。我们用此方法直接检测结核病人痰标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，阳性率分别为65.2%和46.8%，表明结核分支杆菌异烟肼耐药与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG有关，KatG基因在INH耐药中起主导作用。但有一部分耐INH株未检测到KatG缺失或突变，提示某些菌株的耐INH形成可能与KatG无关。如inhA基因、ahpC基因也与INH耐药有相关性 ［3，4］ ，INH耐药机理尚有待进一步研究。同时也表明结核分支杆菌耐利福平与RNA聚合酶的β亚基的编码基因rpoB有关，rpoB突变已成为结核分支杆菌耐RFP的主要遗传指标。已证明90%～95%的结核分支杆菌耐RFP株存在rpoB基因突变，因而可以通过分析菌株的基因型来判定细菌对RFP的药物敏感性。同时有报告称约90%的结核分支杆菌耐RFP株同时也对异烟肼耐药，因而，单独进行RFP敏感性分析也可以作为耐多药的筛选指标。我们的结果也表明，有85.7%的耐INH痰标本中rpoB基因扩增阳性，其中80%发生rpoB基因突变。但rpoB基因和KatG基因突变明显低于临床分离株 ［5，6］ 。这可能与痰标本中杂DNA较多，rpoB为单拷贝，同时痰标本的处理和靶DNA浓度PCR扩增也有直接影响。我们用套式PCR扩增提高了PCR扩增的阳性率，进而为PCR-SSC临床应用提供了条件。本文的结果表明，PCR-SSCP方法具有快速、简便、敏感、特异性高的特点，可在2天内出结果，并能直接用于临床结核病人痰标本结核分支杆菌耐药性的检测。从而弥补了常规药敏实验的不足，有望成为临床耐药性测定的重要手段之一。
参考文献
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作者单位:030053山西省太原市结核病医院
北京解放军第309医院
辽宁省沈阳市胸科医院
（收稿日期:2004-01-17）
（编辑小 川）