B细胞淋巴瘤中错配修复基因GTBP、hMLH1蛋白表达的研究（ 基金项目）

【摘要】 目的 探讨GTBP、hMLH1基因蛋白在B细胞淋巴瘤发生学上的意义。方法 对23例B细胞淋巴瘤细胞进行免疫组织化学EnVinsion法检测GTBP、hMLH1的表达情况。结果 DLBCL细胞GTBP蛋白表达阳性7例（7/11），hMLH1蛋白表达阳性3例（3/6）。FL中GTBP蛋白表达有3例（3/5），hMLH1蛋白表达阳性4例（4/4）。DLBCL中GTBP、hMLH1蛋白表达与FL中GTBP、hMLH1蛋白表达差异无显著性（P>0.05）。原发生于淋巴结有7例GTBP蛋白表达阳性（7/8），有4例hMLH1蛋白表达阳性（4/6），原发生于淋巴结外有8例GTBP蛋白表达阳性（8/13），有8例hMLH1蛋白表达阳性（8/9），原发生于淋巴结内与淋巴结外的GTBP、hMLH1蛋白表达差异无显著性（P>0.05）。高度恶性有8例GTBP蛋白表达（8/12），有4例hMLH1蛋白表达阳性（4/6）;低度恶性有7例GTBP蛋白表达阳性（7/9），有8例hMLH1蛋白表达阳性（8/9），GTBP蛋白在高度恶性与低度恶性表达之间差异无显著性（P>0.05）;而hMLH1蛋白表达在低度恶性较高度恶性高，差异有显著性（P<0.05）。结论 hMLH1和GTBP错配修复基因蛋白表达与B细胞淋巴瘤组织学类型、肿瘤的发生部位可能无关系。hMLH1基因蛋白在B细胞淋巴瘤的发生中可能起一定的作用。

　　关键词 B细胞淋巴瘤 错配修复基因 GTBP hMLH1 免疫组化

The study of mismatch repair gene GTBP and

hMLH1proteins in B-cell lymphoma

Wei Zhonghua，Xie Yuping

The Affiliated Hospiatl of Zunyi Medical College，Guizhou563003.

　　【Abstract】 Objective To evaluate GTBP、hMLH1protein in the pathagenesis of the B-cell lymphoma.Methods Twenty-three cases with B-cell lymphoma were observed about the expression of GTBP and hMLH1proˉteins by the method of immunohistochemistry En Vinsion.Results In DLBCL，the positive cells for GTBP was found in7cases（7/11），the positive signal for hMLH1was detected in3cases（3/6）;the FLrevealed GTBP positive signal in3cases（3/5）and the hMLH1positive signal in4cases（4/4）.Between the DLBCL and FL，no any significant dif_ˉference was found in the GTBP and hMLH1expression（P>0.05）.In the nodal cases，there were7cases showing GTBP positive tumor cells（7/8）and4cases expressing hMLH1positive cells（4/6）.In the extra-nodal site，there were8cases for GTBP positive（8/13）and8cases for hMLH1positive（8/9）.So，between the nodal and extra-nodal sites，there were also no any significant difference detected in the GTBP and hMLH1expression（P>0.05）.In high grade group，we have found8cases were positive for GTBP（8/12）and4cases positive for hMLH1（4/6）.In the low grade group，the GTPB positive cells could be seen in7cases（7/9）and hMLH1positive cells also be found in8cases（8/9）.hMLH1has more expression frequence in the low grade group than that in thehigh grade group（P<0.05），but GTBP was not.Conclusion There are no any relationshipes between the B-cell lymphoma histological cat_ˉegories、the location of tumor and the GTBP/hMLH1expression in the tumor cells.So we consider that hMLH1plays an important role in the pathogenesis of B-cell lymphoma.

　　Key words B cell lymphoma mismatch repair gene GTBP hMLH1 immunohistochemistry

　　错配修复（mismatch repair，MMR）是指细胞对复制错误进行的修复，是生物体维持自身遗传物质稳定性的重要机制。已被克隆的人类MMR基因共有6个，包括hMSH2、hMLH1、hPMS1、hPMS2、hMSH6（GTBP）、hMSH3。这些基因的缺陷可致复制后错配修复功能丧失，引起细胞的高自发突变率，最终导致整个基因组的不稳定性，产生突变体。其中最常见的突变体表型（mutatorphenotype）为微卫星不稳定性（Microsatellite Instability，MSI）。Boyer等报道证实错配修复基因缺陷和微卫星不稳定性改变，两者之间有着十分密切的关系。GTBP、hMLH1是已被克隆的人类MMR基因中的2个。GTBP蛋白染色定位在2p16，其功能是与hMSH2形成复合物，对应的同源物为MutS;hMLH1蛋白染色体定位在3p21.3-23，其功能是与错配点结合并修复，对应的同源物为MutL ^［1］ 。由于DNA错配修复基因发生突变，对错配的修复功能降低，导致微卫星不稳定性，在恶性肿瘤发生过程中的作用受到关注，因此，直接检测肿瘤组织中MMR基因蛋白表达情况能更直观地反映基因的功能状况。目前国内有关MMR和MSI在各型淋巴瘤中的研究较为少见，MMR和MSI在淋巴瘤发病学中的意义和作用仍有待进一步探讨。本研究的目的在于通过免疫组化方法检测错配修复基因GTBP、hMLH1蛋白在B细胞淋巴瘤组织中的表达情况，以期为结合MSI进行综合分析，提供理论参考依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 标本来自1998年1月～2003年11月遵义医学院附属医院病理科的B细胞淋巴瘤档案资料23例。男16例，女7例;年龄最大者69岁，最小8岁。平均年龄46.8岁。男∶女为2.3∶1。所有病例均根据2001年最新WHO分类，均经病理组织学及免疫组织化学检查确诊。其中DLBCL12例，MALT3例，FL5例，BCLL/SLL1例，B-LBL/ALL1例，B-PLL1例。23例B细胞淋巴瘤中发生于淋巴结9例，其中颈部淋巴结有6例。其次分别发生于腹股沟及肠系膜和大网膜淋巴结。原发于淋巴结外的分布较广，有14例，包括胃肠道、阴茎、右上肺叶肿块、脾、胰尾等。所有患者术前均未经过放射治疗或化学治疗。所有标本均经过10%的中性甲醛固定，常规石蜡包埋。根据WHO分类 ^［1］ ，高度恶性组13例（DLBCL12例，B-LBL/ALL1例）。低度恶性组10例（FL5例，BELL/SLL1例，MALT3例，B-PLL1例）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试剂来源 一抗GTBP、hMLH1均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。En Vinsion复合物和DAB显色剂购于基因公司。

　　1.2.2 玻片处理 载玻片于10%重氯酸钾液中浸泡12h，盖玻片浸泡6h，自来水冲洗干净后蒸馏水浸泡，70℃烤箱中烘干，每张玻片上涂抹一层多聚赖氨酸防脱片剂，室温凉干备用。

　　1.2.3 化学处理 免疫组织化学进行En Vinsion法染色。

　　1.3 染色结果的判定 细胞核出现弥漫性棕黄色或棕褐色细颗粒状染色为阳性细胞，反之为阴性。阳性细胞≤25%标记为（+）;阳性细胞25%～50%标记为（++）。阳性细胞>50%标记为（+++）。

　　1.4 统计学处理 实验数据严格按照统计学要求进行收集、整理，建立数据库。采用样本率的四格表Fisher确切概率法检验，P<0.05为对比组间的差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 23例B细胞淋巴瘤组织中GTBP、hMLH1表达结果 见表1。

　　表1 B细胞淋巴瘤组织中GTBP、hMLH1表达结果

　　图1 DLBCL瘤细胞hMLH1 核阳性（ABC×200）

　　2.2 不同组织学类型B细胞淋巴瘤组织中GTBP、hMLH1蛋白的表达 见表2。

　　表2 不同组织类型GTBP、hMLH1表达

　　2.3 不同部位B细胞淋巴瘤组织中GTBP、hMLH1表达结果 见表3。

　　表3 不同部位GTBP、hMLH1表达

　　2.4 不同恶性程度B细胞淋巴瘤组织中GTBP、hMLH1表达结果 见表4。

　　表4 不同恶性程度GTBP、hMLH1表达

　　注: ˇ 与低度恶性组比较P<0.05 高度恶性组13例，有8例GTBP蛋白表达（8/12），4例hMLH1蛋白表达阳性（4/7）。低度恶性组10例，有7例GTBP蛋白表达阳性（7/9），8例hMLH1蛋白表达阳性达（8/8）。GTBP蛋白表达在低度恶性组与高度恶性组中相比较差异无显著性，P>0.05，hMLH1蛋白表达在低度恶性组与高度恶性组中相比较差异有显著性，P<0.05。

　　3 讨论

　　正常情况下，DNA的双螺旋结构是靠A-T，G-C之间的氢键互补配对而维持的，当各种因素使DNA之间的碱基互补配对发生了错误，即形成了DNA的错配。为保证DNA复制的忠实性，维持基因组的稳定性，降低细胞的自发突变，需要对错配的碱基进行修复，即错配修复。发挥这种作用的基因即错配修复基因。当错配修复基因由于突变而不能发挥错配修复功能时，将会出现微卫星的不稳定性。到目前为止，已发现至少有6种错配修复基因与人类肿瘤的发生有关，即hMSH2、hMSH6（GTBP）、hMSH3、hMLH1、hPMS1、hPMS2。前3个与大肠杆菌MutS同源，后3个与MutL同源 ^［2］ 。由于DNA复制、修复过程的复杂性，除了错配修复功能缺陷外，导致MSI还可能存在其它机制，特别是对于大多数非结直肠癌的肿瘤，其MSI的产生可能与错配修复功能无关。现有学者提出，广泛、重度的DNA损伤超过了DNA的修复功能时，也可能出现MSI，这就是所谓的过饱和机制，在这种机制下DNA的错配修复功能是完整的 ^［3］ 。

　　基因的突变将产生有缺陷的蛋白，从而不能发挥错配修复功能，导致微卫星DNA的不稳定性，增加整个基因组的不稳定性，从而引起包括癌基因及抑癌基因等一系列改变，当突变积累到一定程度，就会导致细胞的恶性转化，发生多种肿瘤。hMLH1、GTBP是MMR基因中的2个。hMLH1基因是研究较多的一种，1994年由Bronner等在研究遗传性非息肉形成性结、直肠癌的过程中发现，它定位于染色体的3p21.3-23，基因组DNA全长约58kb（不包括启动子），含19个外显子，cDNA全长2484bp，编码长度为2268bp的