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关键词 CHO-C 28 细胞 NS-1细胞 细胞融合 HBsAg表达量
The study on enhancing expression of HBsAg with the cell fusion
He Wei，Jin Lijie，Li Yong，et al.
Changchun Institute of Biological Product，Changchun130062.
【Abstract】 Objective To enhance the expression of HBsAg.Methods We make the CHO-C 28 cell exˉpressing HBsAg and NS-1cell fuse together，and then determine the titre by RPHA.Results There are transient high expression in the eleventh day after fusion，the titre of HBsAg is1:2048，that of control group is not more than1:256.Conclusion The fusion method can enhance the expression of HBsAg，the result of this experiment provide eviˉdences for further research.
Key words CHO-C 28 cell NS-1cell cell fusion expression of HBsAg
CHO-C 28 细胞是一种能够高效表达HBsAg的重组中国仓鼠卵巢细胞株，目前已投入大规模生产。提高HBsAg的表达水平，不仅可以提高疫苗产量，还会大幅度降低生产成本，一直是我们研究的方向。Cartwright ［1］ 报告，将骨髓瘤细胞SP2/0与能表达t-PA的CHO细胞融合，结果明显提高了t-PA的表达量。据此，我们将CHO-C 28 细胞与骨髓瘤细胞NS-1融合，结果出现了瞬时高表达，表明此方法可以提高HBsAg的表达量。
1 材料与方法
1.1 材料 CHO-C 28 细胞:本室保存种子库提供。NS-1细胞，8-AG，HAT，PEG-4000:由博德公司李勇老师惠赠。DMEM培养基:由美国GIBCO公司生产。小牛血清:由杭州四季青工程材料研究所生产。RPHA试剂盒:兰州生物制品研究所生产。
1.2 方法 ［2］
1.2.1 NS-1细胞的制备 为确保细胞对HAT培养基的敏感性，复苏稳定后，移种于含1%8-AG的DMEM培养基中，融合前1周换用无8-AG的培养液。
1.2.2 CHO-C 28 细胞的制备 复苏稳定的细胞，融合前用不含MTX的培养基传代一次，备用。
1.2.3 细胞融合 采用聚乙二醇法。收集对数生长期的CHO-C 28 细胞与NS-1细胞（比例约为1:2），用单纯DMEM混合后分为3份分别离心，800r/min离心8min，弃上清液，加入50%PEG-40000.8ml于37℃水浴中融合，加预热的单纯DMEM终止PEG作用，800r/min离心6min收集细胞。弃上清液，3份融合细胞分别加入不同的选择培养基轻轻混悬，各移种于96孔培养板，100μl/每孔，37℃，5%CO 2 培养。1号板选择培养基为:1%8-AG+HAT;2号板为:2%8-AG+HAT;3号板为:HAT。培养至第7天时全量换2%8 -AG+HAT液。
1.2.4 对照 融合前留取部分CHO-C 28 细胞，移种于另一96孔板，加完全DMEM培养基，为对照孔。
1.2.5 检测 采用反向血凝法检测HBsAg表达量。
2 结果
2.1 形态学检测 光学显微镜下可见:融合细胞培养至5～7d，3块板未融合的NS-1细胞趋于死亡，7～9d，1号，2号板未融合的CHO-C 28 细胞趋于死亡，杂交瘤出现并缓慢分裂生长，形态呈上皮型，与CHO-C 28 细胞类似，体积稍大。3号板的CHO-C 28 母本细胞与融合细胞共同旺盛生长。未融合的对照细胞生长也很旺盛。见图1。
2.2 HBsAg表达量 融合细胞培养至第11d时检测其血凝滴度，结果3块板均表现出强阳性，其中有2/3孔滴度在1∶1024以上，最高可达1∶2048，而未融合的对照细胞滴度则较低，多数孔为1∶128，仅有少数达到1∶256。但是继续培养并克隆高表达孔，细胞未能持续稳定地高表达。
3 讨论
3.1 选择培养基的改进 传统的B淋巴细胞杂交瘤技术是用骨髓瘤细胞与以特异性Ag刺激的B淋巴细胞融合制备特异性Ab，选择培养基用的是HAT。NS-1细胞及其同核体为HGPRT - ，其合成DNA的主要途径被A（氨甲蝶呤）阻断，又缺乏HGPRT和TK，不能利用培养液中的H，T而死亡。B淋巴细胞及其同核体具有HGPRT和TK，可以通过应急途径合成DNA，但因不能在体外长期培养而死亡。只有杂交瘤细胞具有两种亲本的特性可存活。而NS-1细胞与CHO-C 28 细胞融合后，由于CHO-C 28 细胞是经MTX（氨甲蝶呤）加压筛选出来的，对A耐受， ［3，4］ 而
且在体外可以长期培养，因此单纯用HAT无法杀死未融合的CHO-C 28 细胞及其同核体。我们尝试在1，2号板的HAT培养基中加入不同浓度的8-AG，因为CHO-C 28 细胞为HGPRT+，HG图1 1号板E10孔融合细胞照片， 100×普通光学显微镜 图2 3号板F10孔融合细胞照片， 100×普通光学显微镜PRT对底物要求不强，可以把8-AG结合入核酸中，引起核酸合成的干扰，导致细胞死亡 ［5］ ，而NS-1细胞为HGˉPRT - ，对8-AG耐受，唯有杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，能在HAT+8-AG培养基中选择性存活下来。通过对选择培养基的改进，我们得到了杂交瘤。3号板仍用传统的HAT培养基，结果无法将杂交瘤细胞与未融合的CHO-C 28 细胞及其同核体分开，给新细胞
株的建立及检测带来困难。
3.2 HBsAg表达量的提高 细胞融合后，3块板中有2/3孔出现了瞬时高表达。Houssais ［6］ 和Chencine等 ［7］ 也作过类似的研究，Chenciner用SV40早期启动子在Vero细胞中表达HBsAg，其表达水平仅10ng/（10 6 细胞.d）。当将这些细胞与非洲绿猴或狒狒的肝原代细胞融合后，表达水平提高了50倍，达到514ng/（10 6 细胞.d）。这些都说明通过与骨髓瘤细胞融合提高HBsAg表达量是可能的。在此，我们仅对此方法提高HBsAg表达量进行了初步探索，对于融合 后细胞瞬时高表达的机理尚不明确，得到的杂交瘤细胞也 需进一步检测，而如何能够获得持续稳定的高效表达以及培养条件和选择培养基的作用等还需要进行更深一步的研究。
参考文献
1 李育阳.基因表达技术.北京:科学出版社，2001，2:151.
2 李勇，杨贵贞.人类红细胞血型学实用理论与实验技术.北京:中国科学技术出版社，1999，11:313-320.
3 静国忠.基因工程及其分子生物学基础.北京:北京大学出版社，1999，8:157-158.
4 Kaufman R J，Wasley L C，Spiliotes A J et al.Mol Cell Biol，1985，5:1750-1759.
5 鄂征.组织培养和分子细胞学技术.北京:北京出版社，1994，12:34-35.
6 Houssais JF，Chencine N，Malpiece Y，Zilberfarb D.C R Acad Sci III，1986，303（17）:693-698.
7 Chencine N，Delpeyroux F，Israel N，et al.Biotechnology，1990，8:858-862.
（收稿日期:2003-12-09）
作者单位:130062吉林长春生物制品研究所
（编辑李 木）