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血管内皮细胞具有高度的生物活性，能产生多种血管活性物质和结缔组织的大分子物质。血管内皮细胞功能失调或结构损害在血管损伤后内膜增生性病变形成中起重要作用。研究证明内皮细胞形态和功能对冠状动脉搭桥术后各种搭桥材料桥的远期通畅率有重要意义 ［1～4］ ，而现阶段内皮细胞培养主要在动物实验水平进行或主要培养新生儿脐静脉内皮细胞。目前关于冠状动脉搭桥患者各种搭桥材料血管的内皮细胞培养还未见相关报道，因此本实验的目的是过细胞培养技术来了解冠状动脉搭桥患者桡动脉和大隐静脉内皮细胞培养的可行性，为体外研究血管内皮细胞功能提供重要的实验手段。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂 25cm 2 塑料培养瓶，24孔培养板（Faˉclon）;透射电镜（JEM100CXⅡJEOL）;DMEM培养基（GIBˉCO）;Ⅷ因子相关抗原检测试剂盒（中山生物）;ECGS（enˉdothelial cell growth supplement Sigma）;优级胎牛血清（Hyˉclone）;胶原（Sigma）。余试剂均为国产试剂。
1.2 主要溶液的配制 DMEM培养基加入20%胎牛血清，内皮细胞生长因子50μg/ml，肝素钠50μg/ml，谷氨酰胺 2mmol/L ［5］ 。培养基中未加入抗生素。
1.3 内皮细胞培养方法
1.3.1 人冠状动脉搭桥材料的内皮细胞原代培养 按Jaffe A等 ［6］ 的方法并加以改进。取患者冠状动脉搭桥术后的残余搭桥材料，大隐静脉7根，桡动脉6根（均征得患者及家属同意），长短不等，约2.2～4.8cm，患者年龄42～69岁，排除糖尿病因素。所有剩余材料均在冠状动脉搭桥术中做完近端吻合口后，用装有1×PBS缓冲液的试管取回细胞室进行培养。在超净工作台里用1×PBS缓冲液反复灌洗以洗净血管内腔里的血细胞。继而用0.1%的II型胶原酶在37℃消化10min左右，用含有血清的培养基将消化液冲洗10ml离心管中。然后1000转/min离心10min。弃上清液，用配好的DMEM培养基吹散细胞，取0.1ml在倒置显微镜下用0.4%的台盼蓝染色计数活细胞数，调整细胞数4～5×10 5 /ml，然后接种到25cm 2 塑料培养瓶中，每种材料接种1瓶，在37℃孵育箱里培养。
1.3.2 人冠状动脉搭桥材料的内皮细胞传代培养 原代内皮细胞生长达80%融合后进行消化传代。用培养液冲洗两次，然后用0.25%胰酶1～2ml加入到25cm 2 培养瓶中，边消化边在倒置显微镜下观察。细胞皱缩、彼此分离或呈大片状分离即可终止消化。吸净培养瓶中胰酶，加入含有20%胎牛血清的培养液2ml，吸管吹打，制成细胞悬液，计数后按（4～5）×10 5个细胞/ml，继续培养。一般1瓶细胞传2瓶。
1.3.3 人冠状动脉搭桥材料培养内皮细胞的鉴定 （1）倒置显微镜下观察体外培养的细胞形态并了解其生长情况。（2）电镜下检测Weibel-Palade小体。电镜标本的制备:0.25%胰酶消化细胞后制备成细胞悬液，然后将细胞悬液移到2ml尖头离心管中，3000r/min离心15min。再用1%戊二醛4℃固定40min，然后按电镜标本制作常规经脱水、包埋、硬化等处理后，超薄切片，乙酸铀和醋酸铅染色，透射电镜观察，摄片。（3）内皮细胞Ⅷ因子相关抗原的检测:在24孔塑料培养板孔内放置无菌盖玻片0.5cm×0.6cm，每孔种植1ml含有10 5 个细胞的内皮细胞悬液。待内皮细胞生长至近融合状态时，取出盖玻片，1:1冷丙酮-20℃固定20min，1×PBS冲洗，5min×3次后按说明书进行DAB染色，最后用自来水充分冲洗，复染，封片。
2 结果
2.1 体外培养的内皮细胞的形态 冠状动脉搭桥患者桡动脉和大隐静脉培养的细胞在相差显微镜下，为单层，呈铺路石状镶嵌排列。细胞为呈多角形或椭圆形，互不重叠，边界清楚，胞浆丰富，如图1、2所示。细胞核为圆形或椭圆形，核内染色质稀疏空亮，核仁1～2个。原代培养时，细胞接种后3h左右开始贴壁生长;传代培养时1h左右开始贴壁生长，72h左右分裂开始旺盛，一般12～14d左右达80%融合。开始细胞呈圆形，逐渐变为多角形或长多角形，细胞间相互连接。传代细胞较原代细胞生长旺盛，可见多个双核及核分裂像细胞。细胞传至6～7代时，细胞数目减少，细胞变性变形，脱落，不能继续生长。图1 内皮细胞（大隐静脉）倒置显微镜下（10×10） 结构:细胞呈多角形或椭圆形，互不重叠，呈铺路石状图2 内皮细胞（桡动脉）倒置显微镜下（10×10） 结构:细胞呈多角形或椭圆形，互不重叠，呈铺路石状 2.2 体外培养的内皮细胞的鉴定（1）电镜下可见内皮细胞的特征结构Weibel-Palade小体，Weibel-Palade小体是位于内皮细胞内的棒状成束的微管，周围有膜包被，是内皮细胞的特征性结构。如图3（以大隐静脉为例）所示。（2）体外培养的内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原的鉴定:光镜下可见内皮细胞胞浆被染成棕褐色，而胞核未染色。如图4（以大隐静脉为例）所示。
3 讨论
3.1 内皮细胞体外分离培养方法 目前内皮细胞体外分离培养方法可分为酶消化法、机械刮脱法、组织块贴壁法。后两种易混杂其它血管壁细胞，近几年来已逐渐被酶消化法取代。酶消化法简单，而且获取的细胞纯度高。酶消化法中最常用的酶为胶原酶，其毒性较小，对细胞的损害较小，但费用相对胰酶等较高。本实验即采用胶原酶消化的方法，结果表明这种方法获得的细胞数量多、活细胞计数比例高。同时由于冠状动脉搭桥患者的血管内皮细胞在各种致病因素（如高血压、高血脂）下，功能上可能已经受损，所以采用胶原酶消化应该可以更多的避免这类内皮细胞的受损加重。内皮细胞体外培养取材一般来源于新生儿脐静脉、动物的主动脉及毛细血管等。本实验首次探讨了人冠状动脉搭桥材料桡动脉和大隐静脉的内皮细胞培养的可行性，结果表明这类内皮细胞的培养是可行的。而研究则证明内皮细胞形态和功能对冠状动脉搭桥术后各种搭桥材料桥的远期通畅率有重要意义 ［1～4］ ，因此人冠状动脉搭桥材料内皮细胞的培养成功对于我们在体外了解内皮细胞的功能并建立相关的细胞模型有着比较重要的价值。
3.2 内皮细胞鉴定 关于内皮细胞的鉴定，在常规的内皮细胞培养中，主要是与来自血管壁的平滑肌细胞和成纤维细胞相区分。一般只要能确定（1）椭圆或者多角形的细胞呈典型的铺路石状;（2）互不重叠，接触抑制，就可以准确的与前两种细胞区分。本实验主要是通过电镜下观察Weibel-Palade小体和内皮细胞内Ⅷ因子相关抗原的检测这两种方法 ［7］ 来证实。Weibel-Palade小体是内皮细胞最好的形态学标志，是存在于内皮细胞浆内的特征性结构，为棒状的成束的微管，周围有膜包被。Ⅷ因子相关抗原（Ⅷ-R:Ag）存在于人的血管内皮细胞、巨核细胞和血小板，是血管内皮细胞的一个可靠标记物［8，9］ 。
3.3 内皮细胞培养条件 由于内皮细胞培养的条件较高，结合本实验我们认为应做到以下几点（1）取材要新鲜，尽量缩短取材和细胞培养的时间。因为血管材料脱离了机体组织后，其功能会发生一定的变化而且还会对培养的细胞是否成活产生影响 ［10］ 。（2）培养基中应该加入ECGF（endotheˉlial cell growth factor）或者ECGS，这样细胞一般可以传6～7代或更多，否则一般只能传1～2代。（3）选用进口的塑料培养瓶，有利于内皮细胞的贴壁和生长。（4）血清的质量也很重要，最好使用进口的20%优级胎牛血清，否则细胞贴壁伸展能力较弱，贴壁细胞繁殖速度慢。（5）pH值也是影响细胞生长的因素之一，内皮细胞生长所需的pH值较低（pH7.0左右），不适宜的pH值明显不利于内皮细胞生长。细胞培养中一般要加入双抗（青霉素100IU/ml链霉素100IU/ml）以避免培养过程中细胞的污染。本实验中考虑到内皮细胞培养的条件较高，为减少抗生素对其的影响未在培养基中加入双抗。但本实验中并未发生培养细胞的污染，所以只要在培养细胞的过程中注意无菌操作应该可以避免细胞污染的发生。另外本实验DMEM培养基中加入肝素的目的是因为肝素能延长ECGF或者ECGS的半衰期和增强其活性 ［5］ 。
3.4 内皮细胞培养意义 血管内皮细胞能保持血管内膜的完整性，维持循环血液在血管内的流动状态;具有调节平滑肌张力和血管舒缩的功能;血管内皮细胞能够产生多种血管活性物质，如一氧化氮，前列环素，内皮素等。当内皮细胞的功能出现一种或几种变化时，可导致血管舒缩异常、张力增加;血小板粘附和聚集，凝血活性增强和血栓形成;导致动脉中膜平滑肌细胞增殖，促进动脉粥样硬化的发生和发展 ［11］ 。因此血管内皮细胞受损、血管内皮功能减退是动脉粥样硬化的一个始动和促进因素，血管内皮功能减退已被看作是动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化性心脏病中的一个重要危险因素。因此本实验通过人冠状动脉搭桥材料桡动脉和大隐静脉的内皮细胞培养的成功，为冠状动脉搭桥患者内皮细胞的基础和临床研究提供了一定的依据。
参考文献
1 Cameron A，Davis KB，Green G，et al.Coronary bypass surgery with inˉternal thoracic artery grafts:effects on survival over a15-year period.N Engl J Med，1996，334:216-219.
2 Rammos KS，Koullias GJ.Immunolocalization of basic fibroblast growth factor receptors in internal thoracic artery and saphenous vein grafts.J Thorac Cardiovasc Surg，1997，113:1111-112.
3 Cox JL，Chiasson DA，Gottlieb AI.Stranger in a strange land:the pathoˉgenesis of saphenous vein graft stenosis with emphasis on structural and functional differences between veins and arteries.Prog Cardiovasc Dls，1991，34:45-68.
4 Boyle Jr EM，Lille ST，Allaire E，et al.Endothlial cell injury in cardioˉvascular surgery:atherosclerosis.Ann Thorac Surg，1997，63:885-894.
5 Tiziana B，Lucia morbidelli.Endothelial cells in culture:a model for studying vascular functions.Pharmacological Research，2000，42:9-19.
6 Jaffe EA.Culture of human endothelial cell derived from unbilical veins.J Clin Invest，1973，52:2754.
7 Kiowki W.Endothelial function in humens.Hypertension，1991，18（supˉpl）:846.
8 Jaffe EA.Culture of human endothelial cells.Transplant Proceed，1980，12:495.
9 Jones GE.Methods in Molecular Medicine:Human Cell Culture Protoˉcols.Toto:N J Humana Press Inc，1997，101-109.
10 王建民，刘萌秋，赖西南.正常脐静脉离体后不同时间内某些物质含量的变化.第三军医大学学报，1995，17:86.
11 吴立玲.血管内皮细胞在AS发生中的作用.心血管病理生理学.北京.北京医科大学出版社，2000，8-12.
（收稿日期:2004-03-27）
（编辑李 阳）
作者单位:100034北京大学第一医院心外科
276200山东省蒙阴县人民医院内科