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关键词 肿瘤坏死因子α 氧化型低密度脂蛋白 酰基辅酶A 胆固醇酰基转移酶
Effects of tumor necrosis factor-alpha and oxidized low density lipoprotein on acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase mRNA expression in human monocytic strain U 937
Wang Yi，Sun Baogui，Wen Qinzhu，et al.
Department of Cardiology，First People’s Hospital，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai200080.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of tumor necrosis factor-α（TNFα）and oxidized low density lipoprotein（ox-LDL）on acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase mRNA expression in human monocytic strain U 937 .Methods The cultured U 937 monocytic cells were randomly divided into four groups:control group（C），TNFαtreatment group（TNFαgroup），ox-LDL exposed groups（ox-LDL group）and TNFα-ox-LDL treatment group（TOL group）.The mRNA level of cells was determined with reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）assay.Results Compared with C group，the ACAT mRNA of TNFαgroup and TOL group increased signifiˉcantly（P<0.001），no significantly different between C group and ox-LDL group（P=0.649），TNFαgroup and TOL group（P=0.129）.Conclusion TNFαcan induce the ACATmRNA expression，but ox-LDL had no effect on ACAT mRNA.
Key words tumor necrosis factor-alpha oxidized low density lipoprotein acyl-coenzyme A cholesterol aˉcyltransferase
损伤炎症、胆固醇酯大量堆积促进血管壁单核—巨噬细胞转化为泡沫细胞是动脉粥样硬化发生的早期事件，但是动脉粥样硬化过程中炎症反应和脂代谢紊乱之间的关系还不清楚。炎性因子肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNFα）的多种生物学效应与动脉粥样硬化（atherosclerodsis，AS）有关 ［1.2］ ，而酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶（acyl-coenˉzyme A:cholesterol acyltransferase，ACAT）是促进细胞内胆固醇酯化、沉积的关键酶，也是AS过程的关键酶 ［3］ ，目前最具致AS作用的氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）有上调ACAT酶活性的作用。本研究通过比较TNFα、ox-LDL对ACAT mRNA表达的影响，旨在探讨炎症因子TNFα致AS的机制，进一步阐明AS过程中炎症反应和脂代谢紊乱之间的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺、无血清培养基DMEM/F12、RNA抽提Kit TRIzol reagent和AˉCAT引物均为Gibco BRL产品，青霉素（PG）和链霉素（SM）购自华北制药厂，人血单核细胞株U 937 购自武汉大学菌种典藏中心，TNFα为美国Zeneca公司王洪星教授惠赠，其它产品为国内分析纯或国内进口分装。
1.2 方法
1.2.1 人外周血脂蛋白的分离和氧化 取健康人新鲜血，用超速梯度离心法分离低密度脂蛋白（LDL）、极低密度脂蛋白（VLDL）。蛋白含量以Lowry法检测。加入终浓度为10μmol/L的氯化铜（CuCl 2 ），20℃、24h使其氧化修饰，并在0.9%NaCl溶液中4℃下透析24h。测硫磺代巴比妥酸反应物质（TBARS）值，以判定脂蛋白是否被氧化，LDL和VLDL的TBARS值为1.2～3.2nmol/mg蛋白，ox-LDL和ox-VLDL的TBARS值为63.0～78.5nmol/mg蛋白。
1.2.2 U937细胞株培养及分组 从液氮中取出冻存的细胞迅速放入37℃水浴箱内，待融化后立即加入37℃温浴的RPMI-1640培养基中，离心800rpm×5min。将细胞沉淀悬浮于含10%FBS的1640培养基中，置37℃、5%CO2培养箱中培养。据细胞数及培养基颜色传代换液（一般每周换液2～3次）。细胞数达到预定要求后，离心800rpm×5min，去培养基，用灭菌PBS液洗2次。然后用无血清培养基重悬细胞，细胞计数传代，调整细胞浓度（10 7 个/瓶）。分为4组:（1）对照组（C组）加等量的培养基;（2）TNFα组加入TNFα，使其终浓度10ng/ml;（3）ox-LDL组加入ox-LDL，终浓度为100μg/ml;（4）TNFα+ox-LDL组（TOL组）同时加入TNFα、ox-LDL使其终浓度分别为10ng/ml、100μg/ml。
1.2.3 逆转录—聚合酶链式反应（RT-PCR） 收集上述各组细胞，分别加入变性液（Gibco BRL提取总mRNA试剂盒）2ml，按试剂盒说明书提取总mRNA并逆转录（Gibco BRL逆转录试剂盒）。取2μl cDNA-RNA模板，加入ACAT引物（终浓度为1μmol/L）进行PCR（总体积30μl）。ACAT引物序列及产物长度:5′-GCC TCA GAC AAT ACA ATG G-3′，5′-AAA CAC GTA ACG ACA AGT CC-3′;1610bp。PCR条件为:95℃变性60s，55℃退火90s，72℃延伸4min，共25个循环后75℃延伸10min。同时取2μl cDNA-RNA模板，加入G3PDH引物（终浓度为1μmol/L）:5′-TCC CTC AAG ATT CTC AGC AA-3′，5′-AGATCC ACA ACG GAT ACA TT-3′。PCR条件为:94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环。最后72℃延伸7min。扩增后进行3.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，据产物的分子量大小确定其是否为欲扩增的片段。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像测量系统，测定电泳带的平均光密度值，计算ACAT和G3PDH电泳带的平均光密度值比值，代表ACAT mRNA水平。
1.3 统计学处理 所有数据表示为均数±标准差（ˉx±s）组间比较Levene’s test检测方差齐性后行单因素方差分析及Post Hoc-LSD test多重比较检验。所有统计过程均用SPSS7.5软件在计算机进行，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 细胞模型建立 U 937 单核细胞系来源于人单核细胞白血病病人，实验医学常将它作为研究动脉粥样硬化的细胞模型。其形态学特点是:细胞呈圆形，核大而圆，胞浆少（图1）。表明细胞状态良好，可用于实验。
2.2 细胞总RNA 本实验提取的RNA经紫外测定OD260/OD280比值均在1.7～2.0之间，表明所提取的RNA纯度较高、没污染。甲醛变性凝胶电泳可见5S、18S、28SRNA三条带（图2），其中18S、28S的比值为1:2，说明抽提的RNA完整，没有降解现象可用于RT-PCR。
2.3 RT-PCR测定ACAT mRNA水平 为了探讨TNFα、ox-LDL对U 937 细胞株ACAT基因表达的调控，应用RT-PCR检测其mRNA含量（图3）。TNFα组、TOL组光密度值较另两组显著升高（p<0.05），而对照组、ox-LDL组差异无显著性（表1），表明TNFα能诱导ACAT mRNA表达。
表1 不同处理组ACAT mRNA的表达 （略）
3 讨论
体外实验已证明，ACAT酶是细胞内促进胆醇酯化为胆醇酯的关键酶，血管壁细胞内（如平滑肌细胞和单核巨噬细胞）过量脂质沉积就会形成泡沫细胞，促进AS形成。本研究对TNFα组、ox-LDL组和TOL组ACAT mRNA分析发现，TNFα和TOL组mRNA显著升高，而ox-LDL组mRNA无显著改变，由此推测TNFα具有促进ACATmRNA表达的作用，而ox-LDL对其表达无显著影响。人动脉粥样硬化斑块中可检测到单核-巨噬细胞内有大量ACAT表达 ［4］ 。ACAT有两种亚型———ACAT1和ACAT2 ［5］ ，MP、VSMC内主要是AˉCAT1。它的表达受血脂、地塞米松、细胞因子等多种因素的调节。Ren TJ ［6］ ，Matsuda ［7］ 等研究表明胆固醇上调细胞内ACAT活性，而不改变其mRNA含量，从而认为其是变构酶。而Mazier C等 ［8］ 发现IL-1能激活ACAT，促进胆固醇酯化，并认为其机制可能是促进ACAT酶蛋白合成。
我们的结果在mRNA水平上支持变构酶的观点，但TNFα是否促进ACAT酶蛋白翻译，是否上调其活性，我们日后将作进一步研究。尽管我们没有观察TNFα对ACAT酶蛋白及其活性的影响，但从转录水平上可看出TNFα和ox-LDL致AS作用的机制可能不完全相同:TNFα可能是通过促进ACAT基因转录，增加酶蛋白量的途径促进AS，而ox-LDL可能是通过改变ACAT构型增强其活性机制而致AS。不过，它们又通过影响ACAT而存在联系。可见，AS过程中炎症反应和脂代谢紊乱是相互联系的。（本文图片略）
参考文献
1 Canault M，Peiretti F，Mueller C，et al.Exclusive expression of transˉmembrane TNF-alpha in mice reduces the inflammatory response in early lipid lesions of aortic sinus.Atherosclerosis，2004Feb，172（2）:211-218.
2 Haddy N，Sass C，Droesch S，et al.IL-6，TNF-alpha and atheroscleˉrosis risk indicators in a healthy family population:the STANISLAS coˉhort.Atherosclerosis.2003Oct，170（2）:277-283.
3 Sirtori CR.Newtargets for lipid lowering and atherosclerosis prevention.Pharmacol Ther，199