乙型肝炎病毒荧光定量检测与其血清标志物检测结果的相关性研究

  【摘要】 目的 用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）方法检测乙型肝炎病毒HBV-DNA，了解HBV-DNA荧光定量检测结果与HBV免疫标志物不同类型之间的关系。方法 对220例慢性乙型肝炎患者，用FQ-PCR方法检测乙型肝炎病毒HBV-DNA含量，用ELISA方法检测HBV血清标志物（HBV-M）。结果 HBsAg+/HBcAb+/HBeAg+组HBV-DNA的阳性率为94.9%，HBV-DNA含量也最高。HBsAg阳性组与HBsAg阴性组的HBV-DNA含量差异有显著性（P<0.01或P<0.05），HBeAg阳性组与HBeAg阴性组的HBV-DNA含量差异有非常显著性（P<0.01）。结论 FQ-PCR检测法能够避免常规PCR技术存在扩增产物污染，并能准确定量。HBV-DNA含量与HBsAg、HBeAg的存在有明显关系。HBV-DNA含量可真实反应HBV的感染和复制情况，对临床诊断、药物治疗及疗效观察有重要的指导意义。

　　关键词 荧光定量PCR 乙型肝炎病毒 血清标志物

　　Asscoiations between detection of HBV-DNA by fluorescence

　　quantitative PCRand the HBV serum markers

　　Xiong Yan，Wu Zhiqiang

　　Hospital for Infectious Diseases of Wuhan City，Wuhan430022.

　　【Abstract】 Objective To explore the relationship between the serum contents of HBV-DNA copies and difˉferent types of the HBV serum markers of immunology by FQ-PCR mrthod.Methods The contents of HBV-DNA copies of220patients with HBV chronic hepatitis were detected by fluorescence quantitative PCR（FQ-PCR），and the HBV serum markers by ELISA.Results In the HBsAg（+）/HBcAb（+）/HBeAg（+）group，the positive rate94.9%with the highest contents of HBV-DNA copies.The contents of HBV-DNA had a significant difference between the HBsAg（+）group and the HBsAg（-）group（P<0.01or P<0.05），and there was a significant difference beˉtween the HBeAg（+）group and the HBeAg（-）（P<0.01）.Conclusion FQ-PCR can be used for accurative measurement.The contents of HBV-DNA estimated by FQ-PCR has anobvious link with HBsAg，HBeAg.It can be used to monitor the state of HBV’s infection，replication，and as a guide to clinical diagnosis，pharmacologic therapy and observations of curative effect.

　　Key words fluorescence quantitative PCR hepatitis B virus serum markers

　　荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测法，为定量观察患者体内病毒含量变化提供了灵敏可靠的检测手段。同时还避免了常规PCR技术存在扩增产物易污染，不能准确定量等缺点。为此，本文采用FQ-PCR法，对乙型肝炎血清标志物（HBV-M）阳性的标本进行HBV-DNA荧光定量检测，以探讨HBV-DNA含量与HBV-M不同表现类型的关系及临床义意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 220例慢性乙型肝炎患者为2002年12月～2003年8月住院患者。男164例，女56例，平均年龄（37.4±14.89）岁，诊断符合1995年全国传染病寄生虫病学术会议修订的诊断标准 ［1］ 。

　　1.2 方法 （1）所有研究对象均采集清晨空腹静脉血，立即分离血清。HBV-M检测采用ELISA法，试剂盒由上海实业科华生物技术有限公司提供，严格按试剂盒说明书操作。（2）荧光定量PCR法检测HBV-DNA，试剂盒由深圳市匹基生物工程股份有限公司提供.检测仪器为Roche LightˉCycle荧光PCR检测仪.HBV-DNA提取:取待测血清及试剂盒中的对照品各100μl，分别加到0.5ml离心管中;加入100μl DNA提取液1，振荡混匀，13，000rpm离心10min;吸弃上清液（离心时注意固定离心管方向、尽可能吸弃上清液且不碰沉淀）;再加入25μl DNA提取液2，振荡混匀，2，000rpm离心10s，100℃干浴或沸水浴10min;13，000rpm离心10min，保留上清液备用。取样本、阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照上清液以及阳性工作标准品2μl分别加入Roche毛细管中，2，000rpm离心10s，再将毛细管放入荧光PCR检测仪中检测。扩增条件:92℃1min预变性，然后按92℃5s60℃30s40个循环。仪器自动以阳性工作标准品拷贝浓度的对数值为横坐标，以实际测得的Cr值为纵坐标给出标准曲线，仪器软件自动分析出定量结果。（3）定量结果采用计算对数平均值的方法来计算HBV-DNA平均拷贝数，遇有阴性结果，不参加平均值的统计。其单位采用:拷贝数/ml。

　　1.3 统计学方法 成组设计的方差分析。

　　2 结果

　　220例慢性乙型肝炎血清标志物（HBV-M）不同类型与HBV-DNA含量检测结果见表1。第⑤组HBsAb+/HBcAb+/HBeAb+的HBV-DNA含量检测结果全部阴性，未进行统计学处理。

　　表1 乙肝血清标志物不同类型与HBV-DNA含量检测结果略

　　3 讨论

　　慢性乙型肝炎病程长且迁延不愈，近年来开展的荧光定量PCR技术具有较高的灵敏度和特异性，结果可靠 ［2］ 。血清HBV-DNA含量高低可反映病毒在患者体内的复制情况。拷贝数高，说明病毒核酸含量高，复制活跃，反之亦然。检测HBV-DNA含量，对乙型肝炎患者的临床诊断、药物治疗及疗效观察具有重要的指导意义。从表1可见第①组与②、③、④组相比，HBV-DNA含量的差异有非常显著性（P<0.01），④组与①组，②组和③组相比较HBV-DNA含量差异也有显著性（P<0.01或P<0.05）。第①组俗称“大三阳”，其血清HBV-DNA的阳性率最高，为94.9%。HBV-DNA阳性患者的拷贝数也最高，说明病毒复制非常活跃，有很强的传染性。第②组俗称“小三阳”，其血清HBV-DNA的阳性率明显降低为64.1%，DNA阳性患 者的HBV-DNA含量也低于“大三阳”患者，但仍有超过半数的“小三阳”患者存在病毒复制有较强的传染性。第③组HBsAg+/HBcAb+的临床意义与小三阳相似。这说明HBˉsAg、HBeAg的存在，在一定程度上也能反映HBV-DNA的复制程度。表中还显示，有少数HBcAb+/HBeAb+的慢性乙型肝炎患者，HBV-DNA检测呈阳性。其阳性率较低，为11.1%，HBV-DNA含量也较低。然而这些抗体的检出并不能表明病毒复制的停止，而只是病毒复制水平的降低，在临床诊治过程中对这部分患者应引起关注。

　　参考文献

　　1 病毒性肝炎防治方案（试行）.中华传染病杂志，1995，13:241-244.

　　2 赖宏昌，付晓野，董玉琳，等.荧光探针定量PCR检测HBV-DNA.上海医学检验杂志，2000，15:18-19.

　　作者单位:430022湖北省武汉市传染病医院

　　（收稿日期:2004-06-05）

　　 （编辑 海涛）