中国部分地区耐利福平和异烟肼耐药基因的检测

  【摘要】 目的 研究我国部分地区耐利福平（RFP）和异烟肼（INH）结核分支杆菌临床分离株rpoB基因、KatG基因突变情况，评价其耐药分子机制。方法 采用PCR和聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）对373株结核分支杆菌临床分离株（其中敏感株148株，同时耐RFP、INH株225株）rpoB基因和KatG基因进行检测。并对其中19株SSCP阴性的耐RFP株用双脱氧末端终止法进行测序分析。结果 安徽省、北京市、上海市、河北省、河南省、辽宁省、吉林省结核分支杆菌耐RFP临床分离株rpoB基因突变率分别为90%、91%、90%、91%、90%、93%、91%;KatG基因突变率分别为69%、63%、71%、68%、67%、68%、65%，经统计学处理不同地区间差异无显著性（χ 2 =0.46，P>0.05）。同时rpoB基因敏感株均无突变，特异性为100%;KatG基因有3株发生突变，特异性为98%。19株SSCP阴性耐药株中经测序6株在531位密码子TCG→TTG，1株526位密码子CAC→TAC，7株发生在516位密码子GAC→GTC，5株未改变。结论 我国不同地区耐利福平、异烟肼的rpoB、KatG耐药基因突变率大致相同，rpoB基因和KatG基因突变分别是耐RFP、INH结核分支杆菌耐药性产生的主要分子机制，PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌RFP、KatG耐药性。

　　关键词 分支杆菌 结核 药物耐受性 rpoB基因 KatG基因 DNA序列分析

　　Detection rifampin-resistant and isoniazid-resistant mycobacterium

　　tuberculosis in some areas in China

　　Wang Qing，Jin Yulian，Zhang Xiaogang，et al.

　　Anhui Pulmonology Hospital，Hefei230022.

　　【Abstract】 Objective To evaluate the characteristics of rpoB，KatG gene mutations detection applied resisˉtance in multi-drug resistant clinical isolates of mycobacterium tuberculosis in some areas in China.Methods rpoB，KatG gene mutation of mycobacterium tuberculosis was detected with polymerase chain reaction-single strand conforˉmation（PCR-SSCP）from373clinical isolates，including148drug susceptible strains and225INH and RFP resisˉtance strains.PCR products of isolates that rpoB gene mutations were not found with PCR-SSCP were sequenced usˉing double deoxidization chain terminating.Results Respectively，the rpoB mutation rate was90%in Anhui，91%in Beijing，90%in Shanghai，91%in Hebei，90%in Henan，93%in Liaoning and91%in Jilin.The difference had no significance between the results from these areas（χ 2 =0.31，P>0.05）.The KatG mutation rate was69%in Anhui，63%in Beijing，71%in Shanghai，68%in Hebei，67%in Henan，68%in Liaoning and65%in Jilin.The difference had no significance between the results from these areas（χ 2 =0.46，P>0.05）.Sequence analysis showed14isolates had rpoB gene mutations and the other5isolates were not found rpoB gene mutations.The most frequent rpoB gene mutations sites are Leu-531（6isolates，CAC→TAC），Tyr-526（1isolate，GAC→GTC）and Val-516（7isolate，CAC→TAC）.Conclusion The major mechanism of RFP，INH resistant drug was rpoB and KatG gene mutation.About90%rifampin-resistantclinical strains of mycobacterium tuberculosis from Chain had rpoB mutations，PCR-SSCP is able to apply to detect M.tuberculosis on drug susceptibility.

　　Key words mycobacterium tuberculosis drug resistance rpoB gene KatG gene DNA sequencing

　　我国是结核病疫情最严重国家之一，其主要原因是耐药（DR-TB）和耐多药（MDR-TB）结核病的广泛分布和迅速传播。MDR-TB的流行已成为20世纪全球结核病第三次回升的四大原因之一。因此，对耐多药结核病的研究刻不容缓，耐药问题已成为结核病防治工作中迫切需要解决的问题。做为一线抗结核药物，INH、RFP在结核病的防治、治疗方面起着重要作用。但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。利福平自问世以来以其良好的疗效成为结核病短程化疗的核心和基石，随着分子生物学的不断发展，利福平的耐药分子机制逐步得到确认。有报道 ［1，2］ 认为结核分支杆菌耐利福平与RNA聚合酶的β亚基的编码基因rpoB的突变有关;INH耐药与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因（KatG）有关。我们采用PCR-SSCP技术对我国部分地区共373株结核分支杆菌临床分离株进行检测，研究其地区差异的影响，以进一步探讨其耐利福平和异烟肼的耐药分子机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 菌种和菌株来源 结核分支杆菌H37RV标准株来源于中国药品生物制品检定所。373株结核病人临床分离株来自安徽省肺科医院、北京结核病控制研究所、上海市肺科医院、河南省胸科医院、吉林市结核病防治研究所、沈阳市胸科医院、河北省胸科医院、太原市结核病医院。按结核病细菌学检验操作规程进行菌种鉴定及药敏试验，证实为结核分枝杆菌并同时对利福平和异烟肼耐药。

　　1.2 细菌DNA的制备 采用经典酶解法，临床分离株DNA用常规酚/氯仿抽提法提取-20℃保存备用。

　　1.3 引物 PCR扩增引物由中国科学院微生物所合成。

　　1.4 PCR扩增 采用25μl反应体系，4XdNTPs终浓度为0.2mmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，扩增程序为:94℃变性1min，61℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸10min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳。紫外检测rpoB基因出现258bp条带即为扩增阳性，KatG基因出现282bp条带即为扩增阳性。

　　1.5 SSCP银染分析 PCR扩增阳性的标本进行SSCP检测，扩增产物加等量甲酰胺变性液95℃变性10min，立即冰浴5min，在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，硝酸银染色 后观察结果并照相。

　　1.6 DNA测序 由预防医学科学院病毒所采用双脱氧末端终止法进行，应用PE公司ABI373自动测序仪，amershan phamacia公司测序试剂盒。

　　2 结果

　　2.1 PCR扩增以结核分支杆菌H37RV标准株DNA为对照组 148株药物敏感株和225株耐多药临床分离株rpoB、KatG基因均扩增成功。

　　2.2 PCR-SSCP分析 我们采用PCR-SSCP技术对来自中国七省市不同地区373株结核分支杆菌临床分离株进行了rpoB、KatG基因突变的检测。以H37RV为对照，148株药物敏感株均未发现rpoB基因突变和缺失，特异性为100%;KatG基因突变3株，突变率为72%。耐药株中安徽省、北京市、上海市、河南省、吉林省、辽宁省、河北省，rpoB基因突变率分别为90%，91%，90%，91%，90%，93%，91%，平均突变率为91%。不同地区间rpoB基因突变率差异无显著性（χ2 =0.31，P>0.05）。KatG基因突变率分别为69%，63%，71%，68%，67%，68%，65%。不同地区间KatG基因突变率差异无显著性（χ 2 =0.46，P>0.05）;平均突变率为67%。其中rpoB、KatG基因联合突变率71%（110/154）。见表1。

　　表1 我国不同地区耐RFP和INH结核分支杆菌rpoB、KatG基因突变情况略

　　2.3 对SSCP检测rpoB基因无突变的菌株 随机选取19株进行测序分析，结果显示有14株发生rpoB基因突变，6株为531位密码子TCG→TTC，1株在526位密码子CAC→TAC，7株发生在516位密码子GAC→GTC，5株未改变。

　　3 讨论

　　近年来，结核病的耐药情况十分严重，尤其是耐多药结核病的出现和流行，已成为当前结核病治疗中的一个难题。由于结核分支杆菌生长十分缓慢，常规的耐药检测方法需要纯培养，时间长达1～2个月，因此不能及时指导临床用药，迫切需要新的快速检测结核杆菌耐药性的方法。随着分子生物学的不断发展，PCR技术将广泛用于临床，PCR-SSCP是近年来发展起来的一种检测基因突变技术，尤其是对单碱基置换、点突变检测和筛选具有可靠、简捷、高效的特点。我们采用PCR-SSCP技术对我国七省、市225株耐RFP和INH临床分离株和148株药物敏感株进行rpoB、KatG基因突变的检测，结果表明:中国不同地域耐RFP临床分 离株基因突变率差异无显著性，平均突变率为91%。敏感株均未发现突变。这与国内外报道 ［3］ 相似。证实结核分支杆菌耐利福平与rpoB基因突变密切相关。RFP耐药的产生是由于编码细菌RNA聚合酶的β亚单位发生改变，RFP不能与之结合所致。在我们的研究中，大约有5%～10%的耐RFP临床分离株常规药敏实验为耐药，而PCR-SSCP却未发现突变，因此我们对其中19株SSCP阴性耐药株进行了测序，显示有14株在531位、526位、和516位这三个主要的位点上发生了突变，这与其他国家的报道相似 ［4］ 。

　　另有5株耐药株SSCP和测序均未检测到突变，这可能与方法学本身或常规药敏实验也不一定准确，及有诸多因素影响着SSCP检测结果等有关。无rpoB基因突变菌株的存在，提示除了rpoB基因突变的耐药机制外，还存在其他利福平耐药机制 ［5］ 值得进一步研究。我们的研究结果表明:中国不同地域耐INH临床分离株KatG基因突变率差异无显著性，平均突变率为67%。结核分支杆菌异烟肼耐药与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG有关，KatG基因在INH耐药中起主导作用。但有一部分耐INH株未检测到KatG缺失或突变，提示某些菌株的耐INH形成可能与KatG无关，如inhA基因、ahpC基因也与INH耐药有相关性 ［6］ ，INH耐药机理尚有待进一步研究。同时有报道 ［7］ 90%～95%的耐利福平株也同时耐异烟肼，这样单独进行利福平的药物敏感性分析即可初步判定细菌的耐药谱，因而可作为耐多药的筛选指标。

　　总之，通过应用PCR-SSCP技术对利福平、异烟肼耐药基因的检测，表明其具有快速、操作简便、易行，并使应用传统耐药测定方法须时1～2个月缩短到2天内即