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Han Shengna，Cui Jinjuan，Zhang Zhao，et al.
Department of Physiology，Medical College of Zhengzhou University，Zhengzhou450052.
【Abstract】 Objective To examine the effects of polysaccharide sulfate（PSS）on ionic currents in guinea pig ventricular myocytes.Methods Single ventricular cells of guinea pigs were isolated with a collagenase（I-type）disˉpersion method，using whole-cell recording method to record L-type Ca 2+ current（I Ca，L ）and the inward rectifier K + current（I K1 ）.Results （1）PSS increased the time constant of activation and decreased the current amplitude of I Ca，L .（2）PSS increased not only the inward component but also the outward component of the peak I K1 .PSS decreased the time constant of activiation of I K1 and PSS increased the maximal slope conductance of I K1 .Conclusion PSS deˉcreases L-type Ca 2+ current，increases the inward rectifier K + current.
Key words polysaccharide sulfate ventricular myocytes the patch-clamp technique L-type Ca 2+ curˉrent the inward rectifier K + current
藻酸双酯钠（Polysaccharide Sulfate，PSS）是从褐藻中分离提取再经酯化、磺化等过程而得到的半合成多糖硫酸酯，是一种新的类肝素海洋药物。PSS有改善微循环、增加冠状动脉血流量及抗凝血等作用。已应用于临床冠心病等多种心血管疾病的治疗。另有临床报道:PSS对心肌有一定的抑制作用，可造成房室传导阻滞，然而对这种作用的机制尚未澄清。我室曾采用常规微电极技术引导豚鼠乳头肌的动作电位观察到 ［1］ ，PSS可缩短快反应动作电位的时程，减弱心肌收缩力，降低慢反应动作电位的最大除极速率，缩短慢反应动作电位的时程等，这些作用可能与PSS阻断心肌Ca 2+ 通道有关。为了从离子通道的微观水平进一步研究PSS的作用机理，本实验采用了全细胞膜片箝技术，更深一步地探讨PSS对心肌的作用机理。
本实验是在酶分离豚鼠单个心室肌细胞的基础上进行，采用全细胞膜片箝制技术，分析了PSS对豚鼠心室肌细胞的L-型Ca 2+ 电流（I Ca，L ），内向整流K + 电流（I K1 ）的作用机制，为PSS在临床上合理应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验操作
1.1.1 单个心室肌细胞的分离 ［2］ 选健康豚鼠（由河南省实验动物中心提供），体重（300±50）g，雌雄不拘，棒击头部致昏，迅速剖胸取出心脏，置于4℃的无钙台氏液中洗净心脏中的残留血液，然后将心脏悬挂于Langendorff装置上用动脉夹固定。以无钙台氏液行主动脉逆行灌流3～4min后，换以含牛血清白蛋白（BSA，0.02%）和胶原酶（I型，0.02g/L）的低钙台氏液灌流2～5min（灌流液恒温37℃，灌流速度为6～10ml/min）。待心脏膨松变大，呈海绵状，心肌呈粉红色半透明，流出液为粘条状时，取下心脏，剪去心房和基底部组织，其它部分置于37℃的KB液中保存5～10min后剪成碎块，并用吸管缓慢吹打使之分散成单个心室肌细胞。用200μm的微孔尼龙网过滤去除结缔组织和未消化细胞，滤液于室温下静止1h并复钙以备用。所有液体均充以饱和的纯氧，室温保持在18℃～22℃之间。
在倒置显微镜（Nikon Diaphot300）下可见单个心室肌细胞呈矩形和杆状，横纹清楚。复钙后部分心肌细胞有自发性收缩，短时间内挛缩成团块状死亡细胞，而大部分呈静息状态可供做实验使用。
1.1.2 溶液配制
1.1.2.1 正常台氏液（mmol/L） NaCl135;KCl5.4;MgCl 2 1;CaCl 2 2;NaH 2 PO 4 0.33;HEPES5;Glucose5;用NaOH滴定pH至7.4±0.5。台氏液中除去CaCl 2 即为无钙台氏液。
1.1.2.2 KB液（mmol/L） KOH80;KCl40;KH 2 PO 4 25;MgˉSO 4 3;Glutamic acid50;Taurine20;EGTA1;HEPES10;Glucose10;用KOH滴定pH至7.4±0.5。
1.1.2.3 记录I Ca，L 的电极内液（mmol/L） ［3］ CsCl130;HEPES10;MgCl 2 1;Na 2 ATP2;EGTA1;用KOH滴定pH至7.2。
1.1.2.4 记录I K1 的电极内液（mmol/L） ［4］ KCl120;NaCl10;CaCl 2 1;EGTA10;HEPES5;用KOH滴定pH至7.2。
1.1.3 微电极制备 微电极是用外径为2～3mm的硬质薄壁玻璃毛坯（上海脑研究所提供）经微电极拉制仪（Narishige PP-83）拉制而成。将毛坯管固定在微电极拉制仪上，通以适当的电流使之加热。拉制过程分二步:第一步将玻璃管拉长约7～9mm;第二步将其拉断，使其尖端直径达1～2μm，电极的阻抗在2～3MΩ的范围内，勿需抛光即可形成良好封接。在使用前，微电极要充灌实验所需的电极内液。
1.1.4 全细胞膜片箝记录 取少许细胞悬液置灌流皿中，放于倒置显微镜的操作台上，正常台氏液持续灌流，流速为1ml/min。在显微镜下找到正常的单个心室肌细胞后，用微电极缓慢靠进细胞使细胞与微电极之间达到一个高阻抗封接，即“giga-seal”。然后给与一个脉冲式负压使电极所吸到的细胞膜破裂，电极液与细胞内液沟通并进行交换，即形成“Whole-cell recording”方法。为消除膜电容和串联电阻的影响给以电容补偿和串联电阻的补偿，以保证正常的电压箝制条件和能够记录到稳定的膜电流。记录信号过滤频率为1KHz。
由于有膜电容的存在，实验中记录到的膜电流均以单位膜电容的电流密度来表示（pA/pF）。细胞膜电容C m 的计算公式是:C m =τˇI/V，其中I（pA）是电容波的电流幅度，τ（ms）是未补偿的电容波衰减的时间常数，V（mV）是10mV的去极化脉冲。为了提高箝制速度，一般选择较小的细胞。统计结果显示，平均膜电容为（61.12±2.64）pF（n=30），范围在43.00～92.00pF之间，与相关文献报道的范围（31～136pF）相一致。
1.1.5 信号采集和参数分析 电压箝制、信号采集和储存、刺激信号的发放等由微机程控完成（pClamp5.51件），记录到的跨膜电流信号引入到膜片箝放大器（Nihon Kohden CEZ-2300）放大后，经AD/DA（DigiData1200）转换输入计算机。在膜片箝放大器电压箝制下，记录全细胞的内向或外向离子电流，得到相应的电流曲线。根据电流曲线，以电压为横坐标，相应电流的峰值为纵坐标，作出单个心室肌细胞的电流一电压曲线，即I-V曲线。
1.2 实验程序 采用加药前后自身对照的方法分以下二组进行实验。
1.2.1 PSS对L-型Ca 2+ 电流（I Ca，L ）的作用 使用记录I Ca，L 的电极内液，细胞外液中加入5.4mmol/L的CsCl来取代等浓度的KCl以阻断钾电流。细胞膜维持电位在-80 mV，以保持心肌正常的生理状态，先以时程为100ms的去极化脉冲至-40mV的箝制电位，使钠电流和T-型Ca 2+ 电流失活。然后在实验电位范围为-30mV～+60mV之间，阶跃电压10mV，时程300ms，采样频率4KHz，刺激间隔5s的条件下，得到各个箝制电位时的L-型Ca 2+ 电流值。
实验时首先在膜吸破后每分钟记录一次实验结果，连续记录5min以观察I Ca，L 的“Run-dowm”现象。随后，灌流液中加入50μg/ml的PSS灌流6～9min观察加药前后各个参数的变化。
1.2.2 PSS对I K1 的作用 使用记录I K1 的电极内液，细胞外 液中加入0.3mmol/L CdCl 2 以阻断Ca 2+ 电流 ［5］ 。细胞膜维持电位为-40mV，使钠电流失活。实验电位在0～-170mV之间，阶跃电压10mV，时程400ms，采样频率4KHz，刺激间隔5s，得到各个箝制电位下的I K1 电流值。
膜吸破后先记录正常的I K1 的电流曲线，随后，灌流液中加入50μg/ml的PSS5min后观察加药前后各个参数的变化。
1.3 统计学方法 所有数据以均数±标准误（means±SE）表示，实验前后数据用pClamp5.51软件的自身对照t检验程序进行统计学处理，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 PSS对L-型Ca 2+ 电流（I Ca，L ）的作用 应用全细胞膜片箝技术，记录到了I Ca，L 。该电流一般在-30mV左右时开始出现，为一内向电流，而在+60mV左右时反转成外向电流，在箝制电位为+10mV时该电流达到最大值，并且具有时间、电压依赖性的激活和失活的特性，失活速度较缓慢。众所周知，I Ca，L 在测定过程中随时间的延长会逐渐衰减，即所谓的“Run-down”现象，严重时在10min之内就可使I Ca，L 减少30%～50%，如不加以矫正，则直接影响结果的可靠性。因此，实验中我们设计了I Ca，L 加药前的自身对照。膜吸破后每分钟记录一次I Ca，L ，连续记录5min，观察在此期间I Ca，L 的衰减程度。结果表明:膜吸破后5min时I Ca，L 的电流的幅度是16.80±1.71pA/pF，比膜刚吸破0min时I Ca，L 电流幅度16.86±1.84pA/pF下降了0.38%（n=5，P>0.05）。说明I Ca，L 的“Run-down”现象并不明显。
图1（A）为实验电位在-30～+10mV时，一豚鼠的单个心室肌细胞在膜吸破后5min时正常I Ca，L 的电流曲线;图1（B）为相同的实验电位下，PSS作用9min后的I Ca，L 的电流曲线。从中我们可以看出，加药后的I Ca，L 的电流值明显小于未加药的I Ca，L 的电流值。
PSS的对I Ca，L 的抑制作用，还可以从激活时间常数的变化中得到反映。激活时间常数大，说明激活慢，电流值小;反之亦然。图2显示了箝制电位在-10mV～+20mV时加药前后激活时间常数的变化，从图中可见加药后的激活时间常数变大。箝制电位在+10mV时，激活时间常数从（0.92±0.10）ms增加到了（1.15±0.11）ms（n=5，P<0.05）。
以电压为横坐标，相应电流的峰值为纵坐标，得到I Ca，L 的I-V曲线，如图3所示。可以看出，在箝制电位为+10mV时，PSS使I Ca，L 从16.80±1.71pA/pF减少至13.86±1.67pA/pF（n=5，P<0.01），下降了17.50%。PSS使任何一膜箝制电位下I Ca，L 的减小，I-V曲线明显上移，但I Ca，L 最大值仍在箝制电位为+10mV时出现，并且I Ca，L 原有的电流-电压依赖特征依然存在。
2.2 PSS对内向整流K + 电流（I K1 ）的作用 实验时，以0.3mmol/L CdCl 2 阻断Ca 2+ 电流后，维持电位在-40mV使钠电流失活时，我们记录到了I K1 ，如图4所示。从中可以看出，I K1 的反转电位在-70mV～-80mV之间。并且，该电流既有外向成分，又有内向成分，即在膜电位负于反转电位（E K ）时，I K1 为内向电流;正于反转电位（E K ）时，I K1 为外向电流。同时，电位正于E K 时记录到的外向电流大小，要比电位负于E K 时记录到的内向电流值小，显示出内向整流的特性。而且，随着超极化的加大，激活越来越明显，失活较不明显。图4（A）为豚鼠单个心室肌细胞正常的I K1 的电流曲线;图4（B）为PSS作用5min后同一心室肌细胞的I K1 电流曲线。从这两个图的比较来看，加药后的I K1 电流幅度明显大于未加药时的I K1 电流幅度。
PSS对I K1 的加强作用，还可以从激活时间常数的变化中进一步说明。当箝制电位在-160mV～-100mV之间时，加药后I K1 电流的激活时间常数变小，如图5所示。当箝制电位在-160mV时，I K1 的激活时间常数从加药前的（1.05±0.11）ms减小到PSS作用后的（0.78±0.09）ms（n=7，P<0.01）。以电压为横坐标，相应的电流峰值为纵坐标，得出I K1 的I～V曲线，如图6所示。从上图中可以看出，当箝制电位在-130～-170mV之间时，PSS能够增强I K1 的外向电流幅度。箝制电位在-170mV时，PSS使I K1 的电流幅度从224±16.17pA/pF升高至257±17.36pA/pF（n=7，P<0.01）。下图是将I K1 的外向电流成分放大之后得到的部分I～V曲线。可以看出，当箝制电位0～-60mV之间时，PSS也能使I K1 的外向电流幅度增强，I K1 的外向电流最大值出现在箝制电位为-50mV时。在该箝制电位下，PSS使I K1 的电流幅度从8.89±0.86pA/pF升高至10.38±1.18pA/pF（n=7，P<0.05）。这表明，PSS作用5min后，不仅能使I K1 的内向成分增强，而且也能使其外向成分增强。而在I K1 的反转电位附近时（-70mV～-120mV），PSS作用不明显。
由于I K1 的内向电流成分与电压呈线性关系，因此可以取-100mV和-160mV两个电压点之间的电流差值来计算I K1 的电导。结果如图7所示:PSS作用后I K1 的电导值为2.82±0.20nS/pF，比未加药时的2.53±0.17nS/pF（n=7，P<0.05）明显增加。
（图1～7见附页3～4）。（略）
3 讨论
3.1 PSS对L-型Ca 2+ 电流（I Ca，L ）的作用 钙通道是心肌细胞膜上最重要的膜蛋白之一。通过开放钙通道的内向电流可决定所有心肌细胞动作电位的时间和复极期的长短，起搏细胞的舒张期除极和心脏的节律，以及结细胞动作电位的爆发和传导速度，并且，钙离子也是心肌兴奋-收缩耦联的基础。可见，钙通道在心肌细胞的电生理方面起着重要的作用。我们的实验设计重点在于观察PSS对I Ca，L 的作用。
实验时首先观察了I Ca，L 的“Run-down”现象，发现其“Run-down”现象并不明显。这是因为我们一般是在破膜稳定10min以后才进行实验的。当膜被吸破后，电极内液与细胞内液的交换需要一个过程，而该过程稳定后再做实验可消除I Ca，L 的“Run-down”现象的影响，从而记录到稳定的I Ca，L 。箝制电位为+10mV时，I Ca，L 幅度最大，这与文献报道的相一致。在该箝制电位下，PSS的I Ca，L 幅度从16.80±1.71pA/pF减少至13.86±1.67pA/pF（n=5，P<0.01），下降了17.50%，说明PSS能够在6～9min内引起I Ca，L幅度的减小。我们进一步观察了PSS对I Ca，L 激活时间常数的作用，PSS能使I Ca，L 激活时间常数变大，激活时间常数变大，说明激活过程变慢，电流减小，进一步解释了的PSS抑制I Ca，L 的原因。这些结果与我室先前使用玻璃微电极细胞内记录所得出的结论完全相符，从而从离子通道水平进一步证实了PSS很可能是一种钙离子拮抗剂。
3.2 PSS对内向整流K + 电流（I K1 ）的作用 已知，I K1 是广泛分布的一种钾通道亚型的电流，这一电流主要参与心房肌、心室肌静息电位的形成，并影响复极化的第3期，它对细胞的兴奋、传导以及最大去极速度均有影响。钾离子外 流增加可以导致动作电位时程的缩短，因此，I K1 在心肌细胞的电生理方面具有重要意义。
我们在实验中，记录到的I K1 的电流曲线与有关文献所报道的哺乳类动物的心室肌细胞（如猫、大鼠、人类等）的I K1 的特性相一致。I K1 有激活过程，而且随超极化的加大激活也加快，并且失活也逐渐明显。同时，随超极化的加大，I K1 具有时间依赖性。因此，I K1 具有时间和电压依赖性。I K1 的反转电位在-70mV～-80mV之间，与文献报道相一致。I～V曲线显示出内向整流的特点，即在膜电位负于反转电位时I K1 为内向电流，且内向电流与电压呈线性关系;相反，膜电位正于反转电位时I K1 为外向电流，但外向电流与电压不呈线性关系，而呈内向整流现象。据报道，I K1 的内向整流的机制是由于细胞内阳离子浓度，特别是镁离子浓度对钾离子的外向电流起抑制作用，因之显示其整流性质。但也有报道指出，I K1 可能是被细胞内其它物质（如多胺）以电压依赖性方式所抑制。I K1 还有一个随去极化的加大电流反而减小的现象，这称之为负坡度（Negative Slope）。如图5所示，当去极化至-50mV时，I K1 的外向电流达到最大值，随后，随着去极化的加大，I K1 的外向电流幅度反而减小。
我们通过分析PSS对I K1 的激活时间常数和其对电导的影响，更深一步的解释了PSS的作用机制。PSS作用后I K1 的激活时间常数变小，这说明激活速度加快，造成I K1 电流加大。同时，I K1 的电导变大，说明心肌细胞膜上电流通过内向整流K + 通道的能力加大，电流变大。实验得出，PSS不仅能够增加I K1 内向电流的幅度，还能够增加I K1 外向电流的幅度，而在反转电位附近时，I K1 的电流幅度没有显著变化。从生理意义上来说，PSS能够增加I K1 外向电流显得更为重要。I K1 电流的加大，能够引起复极速度加快，动作电位时程的缩短。这可以解释我们用常规电生理方法观察到的PSS使动作电位时程缩短的现象。
综上所述，本实验采用全细胞膜片箝技术，在Ⅰ型胶原酶分离细胞的基础上，观察了PSS对豚鼠单个心室肌细胞离子电流的影响。结果表明，PSS能抑制L型Ca 2+ 电流，增强内向整流K + 电流，导致动作电位时程的缩短。这些结果与我室先前采用常规微电极技术所得结论是相吻合的。
参考文献
1 Tang Y（汤蕴），Tang SB（汤树本），Zhang HY（张海燕）.Inhibitory actions of polysaccharide sulfate on action potentials and contration of papillary muscles in guinea pigs.Acta Pharmacologica Sinica（中国药理学报），1999，20:249-252.
2 Liu GX，Gu QB，Guo Q，et al.A simple，rapid method to isolated cardic myocytes from rat and guinea pig.Chinese J Appl Physiol，1997，13（4）:361-362.
3 Gallo MP，Ghigo D，Bosia A，et al.Modulation of guinea-pigcardiac L-type calcium current by nitric oxide synthase inhibition.J Physiol，1998，506（3）:639-651.
4 Ducic CM，Shuba Ko Y，Morad M.Comparative effects of loratadine and terfenadine on cardiac K + channels.J Cardiovac Pharmacol，1997，30:42-54.
5 Guillermo C，Bertran MC，Biagetti ER，et al.Effects of amiodarone and desethylamiodarone on the inward rectifying potassium current（I K1 ）in rabbit ventricular myocytes.J Cardiovasc Pharmcol，1998，31:914-920.
（收稿日期:2004-05-18）
作者单位:450052河南郑州大学医学院生理教研室
（编辑李 木）