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关键词 NAT 全自动 核酸提取 HBV DNA
Application of nucleic acid entirely automated extraction method on HBV DNA in blood screening
Ye Xianlin，Wang Lianghua，Shang Guifang，et al.
Shenzhen Blood Center，Shenzhen518035.
【Abstract】 Objective To investigate and study Roche nucleic acid entirely automated extraction method on HBV DNA in blood sample pooled by sampling processor.Methods Individual donor plasma samples serologically negative for HBV were pooled by STAR2000according to the size24，Using entirely automated extraction method to extraction nucleic acid simultaneously，amplified and detected by Roche COBUS AMPLICOR system，evaluating the sensitivity，efficacy and anti-interference.Results The95percent cutoff for HPLC HBV DNA test was39.6IU/ml，20mg/dl bilirubin，1g/dl hemoglobin and medium lipid blood did not interfere with the results.Conclusion Entirely automated extraction method by MPLC can be applied in the blood screening.
Key words NAT entirely automation nucleic acid extraction HBV DNA
核酸扩增技术（NAT）能显著缩短EIA的“窗口期”和检出病毒变异株，降低血源性病毒的传播，是血液筛查病毒的最有效的手段 ［1，2］ 。由于在大批量进行血液筛查时手工混样繁琐、难标识，且核酸手工提取技术要求高、操作繁杂、耗时及结果重现性差，已不适合现代化血液检测的需要。为探讨在国内血液筛查应用全自动核酸提取技术，笔者与德国Roche合作，在国内首次开展全自动样本汇集及全自动核酸提取技术评价研究并应用于日常工作，现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料 瑞士HIMILTON STAR2000加样仪，德国Roche MagNA Pure LC核酸提取仪，COBAS AMPLICOR核酸扩增检测仪，COBAS AmpliScreen HBV V1检测试剂盒，德国Hettich离心机，72管带盖留样板，HIMILTON一次加样针（1000μl）。美国Acrometric HBV DNA国际标准品。
1.2 方法
1.2.1 样本准备和汇集 将采集的5ml EDTA抗凝全血保存2℃～8℃冰箱里，待血液样本经相应的7项检测合格后，800～1600g室温离心20min后，装载样本条架上，应用STAR2000，启动一级汇集程序，进行24例份样本汇集和档案板的留存。将每个汇集池的样本条码文件储存并输出以备追溯和确认使用。若第一级汇集样经检测为阳性，将档案板取出，启动二级汇集程序进行第二级每6个样本的汇集，同时取出留存的样本条码进行记录，以被确认最终阳性标本。由于一级汇集池阳性概率很少，二级汇集亦可手工进行。
1.2.2 核酸全自动提取 按控制软件要求将所需要的纯化试剂洗涤缓冲液、蛋白裂解液、磁珠及所有耗材等装载在MagNA Pure LC核酸提取仪工作台上，汇集池混合样取1000μl及阴阳对照最后放入。开启仪器约1h后自动完成核酸提取。
1.2.3 核酸扩增及检测结果 在A-Ring上分别加入Mn 2+ 溶液及纯化的核酸样液，置入COBAS AMPLICOR核酸扩增检测仪上，按要求装载变性液、内标、酶和显色剂，仪器自动完成扩增和检测。内标阳性，样本阳性报阳性结果。
2 结果
2.1 方法检出限量 将已知浓度的HBV DNA和HIV RNA标准品用阴性血浆稀释成样本，浓度范围分别为1～500U/ml，进行MPLC核酸全自动提取，结果见表1。应用PROBIT概率统计（STATA3.0）计算95%检测限量，HBV DNA MPLC全自动提取法为39.6U/ml。
表1 MPLC全自动提取HBV DNA检测结果（略）
2.2 MPLC全自动核酸提取方法抗干扰实验结果 对50U/ml HBV DNA质控样本，分别加入20mg/dl胆红素，1g/dl的血红蛋白及中等脂肪血的血浆，均能定性检出。
2.3 质量控制 以阴性血清（NHP）稀释HBV DNA国际标准品，分别制成浓度为50U/ml样液，随23管阴性样本一起用加样程序分别进行制备汇集池，重复8批次，均能定性检出阳性。
2.4 常规应用 共对5136例份样本计214个汇集池进行扩增检测，HBV DNA检测阳性6份，经对献血员重新采血单份检测仍为阳性，HBV DNA阳性率为0.12%。该实验尚在进行中。
3 讨论
NAT检测可以大大缩短窗口期及可以检出病毒变异株，许多国家已常规用于血液筛选 ［3，4］ 。而核酸提取是NAT检测过程最重要也是最难控制的部分，常规手工不仅需要专门技术人员，且耗时耗力，不适合大批量血液筛查，尽管日本已有全自动核酸提取系统应用于血液筛查的研究 ［5］ ，但其专门设计自动化核酸提取纯化设备推广常规应用尚待时日。本研究在我国已有加样设备基础上开发全自动样本汇集，在MPLC上进行全自动核酸提取，最后在COBAS AMPLICOR上扩增和检测，实现从样本准备、核酸提取及扩增和检测一体化和自动化，符合大批量的NAT血液检测中心工作流程的需要。是国内首次将NAT全自动系统应用血液筛查的尝试。
我国是乙肝的高度流行区，流行病学调查结果显示人 群中HBsAg的携带率已上升至10.12%，而目前血液筛查使用的ELISA方法，由于存在“窗口期”、基因变异及低水平携带等原因，使得血液筛查有一定的漏检。给临床用血安全带来极大威胁。本实验结果显示，在ELISA检测合格结果中，HBV DNA阳性率为0.12%，低于国内献血者的检出率 ［4，6］ 。主要由于我中心使用了高灵敏度的乙肝进口试剂以及在采血前对乙肝和ALT进行初筛的原因。
为防止检测结果出现假阳性，在检测液中配有AmˉpErase酶，在PCR实验开始后50℃保温5min时该酶被激活，切除核酸链中U碱基，将可能存在的前次扩增产物降解，达到消除产物污染产生的假阳性。另外在试剂中采用内质控（IC），含有HBV DNA的与引物结合区域及与独特探针结合区，能监控样本裂解、抽提、扩增和检测整个过程，保障结果的可靠性。
核酸提取是PCR过程中首要一步，却是最后一个实现自动化的步骤，MPLC是世界上首批实现全自动核酸提取的成套设备，该系统自动释放靶物核酸，由特异性寡糖核苷酸探针捕获靶物，此探针通过生物素-链霉亲和素结合反应与磁珠附着，核酸就被自动纯化和浓缩，从而完成核酸自动化提取。该方法灵敏度高，能在1h内同时完成480例份HCV RNA/HIV-1RNA/HBV DNA全自动核酸的提取，比传统手工方法提前1.5h，且手工操作时间仅15min左右，大大提高工作效率，具有广阔的应用前景。
参考文献
1 叶萍.核酸扩增检测技术预防输血传染病的应用现状及研究进展.国外医学·输血及血液学分册，2003，26（5）:399-402.
2 白坚石.原料血浆混样HCV/HIV-1核酸检测的方法学研究.中国输血杂志，2003，16（3）:309-312.
3 H TM Cui jpers.Validation of NucliSens Extractor in combination with the hepatitis C virus Combas Amplicor2.0assay in four laboratories in the Netherlands Utilizing nucleic acid amplification technology for blood screening.Vox Sanguinis，2001，（81）:12-20.
4 黄呈辉.核酸扩增检测在血液筛查的初步应用.中华检验医学杂志，2001，24（3）:141-143.
5 Q.Meng.全自动多重检测试剂同时检测HBV DNA，HCV RNA和HIV-1RNA。国外医学·输血及血液学分册，2003，26（3）:280-282.
6 胡兆平.荧光定量PCR技术在血液筛查中的应用及可行性分析.临床输血与检验，2002，4（1）:7-9.
（收稿日期:2004-04-25）
作者单位:518035广东深圳深圳血液中心
（编辑守 中）