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1 材料与方法
1.1 实验动物 SD大鼠（4～5周）雌雄不限，体质量50～70g，由河北医科大学动物实验中心提供。
1.2 主要试剂与装置 胎牛血清（杭州四季青公司），DMEM（Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（Gibco公司），小鼠抗大鼠神经细胞特异性烯醇化酶（NSE），胶质纤维酸性蛋白（GFAP），L-谷氨酰胺（Gibco公司），DAB显色试剂盒，购自博士德公司，CO 2 恒温培养箱，倒置相差显微镜，丹参粉针。
1.3 骨髓基质细胞的分离与培养 取SD大鼠，乙醚麻醉后，在无菌条件下取双侧股骨、胫骨，除去肌组织，剪开骨两端，用注射器抽取2ml肝素（625U/ml），从骨的一端缓慢冲洗骨髓腔，收集所得悬液至离心管，加D-Hanks液稀释后行密度离心，1000转/min，10min，去上清，加20%DMEM液吹打成细胞悬液，移入50ml培养瓶中，于37℃、5%CO 2 饱和温度条件下培养。5天后半量换液，以后3天半量换液，于10天左右原代细胞增殖接近融合，用0.25%胰酶消化细胞，按1∶2传代。
1.4 骨髓基质细胞的诱导分化。骨髓基质细胞传代至第2～6代后，胰酶消化，培养于24孔培养板中（孔中放有无菌盖玻片），待细胞生长至50%融合状态时，加入丹参粉针，诱导5天后，经免疫组织化学染色鉴定分化后的细胞对NSE，GFAP等特异性标志物的表达情况。
1.5 骨髓基质细胞诱导分化后的免疫组织化学鉴定 诱导5天后，将细胞爬片取出，用4%多聚甲醛固定15min，PBS液洗涤2次，加入过氧化物酶阻断剂，非免疫性动物血清封闭，以后分别加入NSE和GFAP单抗，37℃温箱孵育40min，PBS洗涤3次，每次5min，加入生物素标记的二抗，37℃温 箱15min，PBS洗涤后加入三抗，温箱15min，DAB显色5～15min，显微镜下观察。
2 结果
2.1 骨髓基质细胞的生长情况 原代培养的细胞接种24h 后，可见有少数细胞开始贴壁生长，细胞形态呈梭形，第5天后细胞增殖加快，呈团簇集落样生长，贴壁细胞转多，10天左右细胞铺满瓶底达融合状态。
2.2 丹参粉针对骨髓基质细胞的诱导作用 诱导时细胞生长状况影响诱导效果，诱导时细胞不能长满，本试验诱导时细胞达50%融合时诱导效果最好，在用丹参粉针诱导3天后细胞开始变形，1周后有大量双极或多极的神经原样细胞出现。
2.3 免疫组化结果 培养细胞经诱导分化培养1周后，神经元特异性抗原（NSE）和神经胶质细胞特异性抗原（GFAP）阳性表达的细胞出现，表明这些细胞具有神经系细胞的特性。
3 讨论
骨髓组织可分为造血和基质两大部分，骨髓基质细胞（BMSCs）是骨髓中除造血干细胞以外的非造血干细胞，其具有多分化潜能，近年来的研究表明，BMSCs可向脂肪细胞、网状细胞、肌肉细胞、成纤维细胞、神经细胞等方向分化。其优点有:（1）易于贴附于塑料培养板为特征;（2）易于分离、纯化和体外扩增;（3）在特定条件下可向神经元分化。Woodbury等报道了在体外将骨髓基质细胞诱导分化成神经细胞，我们通过研究丹参粉针对骨髓基质细胞的诱导作用，发现此药可诱导骨髓基质细胞成为神经细胞，可表达NSE和GFAP，表明丹参粉针可诱导骨髓基质细胞分化为神经细胞和神经胶质细胞。
（收稿日期:2004-07-19）
作者单位:066400河北省秦皇岛市卢龙县医疗保险诊所
（编辑曲 全）