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Sun Zheng，Li Mei，Xue Yintong
The Medical Unit，Beijing University，Beijing100083.
【Abstract】 Objective We and others have earlier reported that Anti-CD3antibody could induce thymocytes undergoing apoptosis in vivo，and this induced apoptosis could be inhibited by pre-treatment of glucocorticoid recepˉtor antagonist RU486.The effects of F（ab′） 2 and Fc fragments of anti-CD3antibody inducing thymic apoptosis have been observed separately，to show the different roles of different fragments，in order to clarify the mechanism involved.Methods The F（ab′） 2 fragment of anti-CD3antibody was purified，concentrated and identified following pepsin digestion.The early apoptosis of the thymocytes after4hours was assayed using TUNEL in-situ staining.And the late apoptosis of the thymocytes after20hours was assayed by using anti-CD4/CD8double fluorescence staining and by thymocytometry and thymus weighting.Results The F（ab′） 2 fragment of anti-CD3antibody couldn’t induce the apoptosis of mouse thymocytes.However，the F（ab′） 2 fragment plus its secondary antibody could induce significant apoptosis of BALB/c mouse undeveloped thymocytes and this effect could be partially inhibited by RU486.Conclusion Thymocytes are killed by TEC（Thymic epithelial cell）produced GC，briged by anti-CD3antibody.
Key words thymus T cell anti-CD3antibody apoptosis glucocorticoid
自从上世纪80年代开始糖皮质激素诱导胸腺未成熟T细胞凋亡便成了研究的热点，人们对其发生的机制已经了解很多，知道其主要是以GR（糖皮质激素受体）为前提和基础的多因素多途径的内源性死亡过程 ［1］ 。同时我们也注意到，仓鼠抗小鼠CD3ε单克隆抗体（2C11）同样可以引起小鼠未成熟胸腺细胞发生显著的凋亡［2，3］ ，而且凋亡的效应也可以被RU486抑制。本实验针对抗体Fc片段的有无对于胸腺细胞凋亡的影响，结合RU486在抑制凋亡过程中所起的作用，探讨抗CD3抗体诱导小鼠未成熟胸腺细胞凋亡的机制。
1 材料和方法
1.1 材料 健康BALB/c雄性小鼠，4周龄，由北京大学医学部动物实验中心提供。2C11购自美国SouthernBiotech公司。PE标记的抗CD4抗体、FITC标记的抗CD8抗体由本实验室自制。Protein A-sepharose cl-4B层析柱以及Sephacryl s-200层析柱皆购自Amersham公司。
1.2 高纯度2C11-F（ab′） 2 片段的制备、纯化、浓缩和鉴定 为胃蛋白酶消化法 ［4］ ，产物分别经Protein A-sepharose cl-4B层析柱以及Sephacryl s-200层析柱纯化;透析、浓缩后利用SDS-PAGE和流式鉴定。
1.3 实验动物分组与给药 BALB/c雄性4周龄小鼠，分为7组，每组6只。小鼠一律腹腔注射给药:a-空白对照组;b-F（ab′） 2 组;c-抗F（ab′） 2 对照组;d-抗CD3抗体阳性对照组;e-抗CD3抗体RU486抑制组;f-F（ab′） 2 +抗F（ab′） 2 组;g-F（ab′） 2 +抗F（ab′） 2 RU486抑制组。
1.4 检测早期凋亡 4h后将小鼠脱颈处死，取胸腺，用10%的甲醛溶液固定，12～24h取出，石蜡包埋，切片。根据试剂盒说明书操作，TUNEL原位凋亡细胞染色，显微镜下观察结果。另一部分胸腺组织经200目筛网研磨得到单细胞悬液，FITC-annexin V染色，流式细胞计数法检测凋亡细胞。
1.5 检测晚期凋亡 20h后将小鼠脱颈处死，取胸腺，进行胸腺称重、单细胞悬液光学显微镜下细胞计数以及单细胞悬液抗CD4/CD8荧光双染经流式细胞仪检测。
1.6 统计学方法 实验数据以均数±标准差表示。（ˉx±s）采用SPSS8.0统计软件进行单因素成组方差分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 8%SDS-PAGE电泳鉴定抗CD3单抗经胃蛋白酶消化并纯化的产物F（ab′） 2 如图1所示，上样缓冲液为非还原性，所以分子内部二硫键保持完整，在大约110kD分子量处呈现均一的条带，60kD处似乎有一条隐约的条带，可能是处理样品过程中产生的二硫键断裂所致。从左至右依次为Marker、胃蛋白酶消化前的抗体、消化产物F（ab′） 2 片段。
2.2 应用流式细胞术鉴定抗CD3单抗经胃蛋白酶消化并纯化的产物F（ab′） 2 如图2，间接标记法表明，空白对照组无法被抗仓鼠IgG的FITC荧光抗体标记，而事先包被细胞表面CD3分子的F（ab′） 2 和Anti-CD3全抗体组则可以被荧光二抗标记，两者曲线形状相似，说明F（ab′） 2 片段具有较强结合CD3分子的能力。
2.3 TUNEL法原位检测小鼠胸腺细胞早期凋亡 4h后，小鼠胸腺组织取出，制成石蜡切片，TUNEL法所示各组结果（图3），从图中可见空白对照组（a）、F（ab′） 2 对照组（b）以及抗F（ab′） 2 对照组（c）胸腺组织几乎看不见凋亡细胞;抗CD3阳性对照组组（d）以及F（ab′） 2 +抗F（ab′） 2 组（f）胸腺组织出现了显著的凋亡，凋亡细胞呈深棕色，散在分布或者聚集成环形（环内有细胞结构存在）;而它们相应的RU486 保护组（e和g）胸腺组织则只见少量散在分布的凋亡细胞。
2.4 流式细胞计数法分析胸腺CD4 + CD8 + 细胞比例变化 腹腔注射药物20h后，CD4 + CD8 + 双染，结果统计学处理见表1，空白对照组（a）、F（ab′） 2 组（b）以及抗F（ab′） 2 对照组（c）比例大体一致，在80%左右;抗CD3组（d）以及F（ab′） 2 +抗F（ab′） 2 组（f）双阳性比例下降了约15%;而它们相应的RU486保护组（e和g）双阳性比例仅有较小幅度的降低（约5%）。
2.5 光学显微镜下小鼠胸腺单细胞悬液细胞计数 20h 后，显微镜下计数小鼠胸腺单细胞悬液的细胞，统计学处理见表1，空白对照组、F（ab′） 2 组以及抗F（ab′） 2 对照组细胞数目大体一致，在（190～210）×10 6 之间;抗CD3组以及F（ab′） 2 +抗F（ab′） 2 组细胞数目明显减少，（减少了约60%）;而它们相应的RU486保护组，细胞数目降低幅度减轻（仅减少了30%）。
2.6 小鼠胸腺称重 腹腔注射药物20h后，电子天平称量小鼠胸腺重量，结果统计学处理见表1，空白对照组、F（ab′） 2 组以及抗F（ab′） 2 对照组胸腺重量大体一致，相差在10mg以内;抗CD3组以及F（ab′） 2 +抗F（ab′） 2 组胸腺重量明显减轻，（减少了约40%）;而它们相应的RU486保护组，胸腺重量仅有较小幅度的减轻，说明抑制了抗体所导致的细胞的凋亡。
表1 20h后小鼠胸腺重量、活细胞计数、CD4/CD8荧光双染结果 （略）
注:a:与2，3组相比，P>0.05，n=6;b:与4，5，6，7组相比，P<0.01，n=6;c:与4，5，6，7组相比，P<0.01，n=6;d:与5组相比，P<0.01，n=6;e:与6组相比，P>0.05，n=6;f:与6组相比，P<0.01，n=6;g:与5组相比，P>0.05，n=6
3 讨论
Yintong Xue ［5］ 等人已经证明胸腺上皮细胞（Thymic epˉithelial cell，TEC，胸腺上皮细胞的主要成分）可以分泌糖皮质激素，而且本实验也可以观察到糖皮质激素受体拮抗剂RU486对凋亡的保护作用;糖皮质激素受体（GR）基因敲除小鼠，其对抗CD3抗体引起的凋亡具有很强的抵抗性 ［6］ ;把抗体Fc段切除，单独的F（ab′） 2 片段无拉近效应，无凋亡;加以抗F（ab′） 2 的二抗将两种细胞重新连接起来，再次出现凋亡效应，而且在凋亡程度、凋亡表现等方面与全抗体所致呈现极度的相似性，与Fc片段的来源（自身或者异源性）无关，更印证了我们的设想。
胸腺石蜡切片TUNEL染色原位检测细胞早期凋亡可见，很多的凋亡细胞围绕某一细胞结构形成环状，我们分析有可能是胸腺上皮细胞以桥梁连接的方式存在于胸腺细胞周围;或者是巨噬细胞等待吞噬即将形成的凋亡小体。抗CD3抗体引发的胸腺细胞凋亡是非常迅速的，凋亡细胞最 终要形成凋亡小体，被巨噬细胞等吞噬，转运至胸腺外，会造成胸腺细胞数目减少、胸腺重量减轻，与我们的实验结果相吻合:单独的F（ab′） 2 片段不能造成上述变化，而F（ab′） 2 与抗F（ab′） 2 的二抗同时应用则可以显著引起胸腺细胞凋亡（与抗CD3抗体阳性对照组一致），且这种凋亡的效应可以被RU486部分抑制。抗CD4/CD8荧光双染显示凋亡的细胞主要为CD4、CD8双阳性细胞，这与糖皮质激素引发的胸腺细胞凋亡结果一致 ［7］ 。
为排除小鼠体内胸腺以外的糖皮质激素来源，我们将小鼠双侧肾上腺切除，再重复上述实验，除部分小鼠给药后死亡外，从现有的部分数据来看，与前述实验结果是平行的（结果未给出），因而具有更强的说服力。
综上所述，我们由实验中所得出的结论是:抗小鼠CD3单克隆抗体诱导BALB/c小鼠未成熟胸腺细胞凋亡，且凋亡效应可以被糖皮质激素受体阻滞剂RU486部分抑制，提示这种凋亡与GC/GR密切相关;在此过程中，Fc与Fc受体相互作用起重要作用;抗CD3抗体引起凋亡机制之一可能为:胸腺内的抗CD3抗体通过Ag-Ab和Fc-FcR的连接方式桥梁连接了发育中的T细胞与胸腺基质细胞，在胸腺基质细胞释放的糖皮质激素作用下，引起邻近胸腺细胞的凋亡。
（本文图片见附页1）（略）
参考文献
1 Thompson EB.Mechanisms of T-cell Apoptosis Induced by Glucocorˉticoids.Trends Endocrinol Metab，1999，10（9）:353-358.
2 Vathsala A，Chin YM，Noraiza I，Sun.Inhibition of apoptosis in anti-CD3-treated peripheral blood lymphocytes by immunosuppressive drugs.Transplant Proc，2000，32（7）:1992-1994.
3 Migita K，Eguchi K，Kawabe Y，et al.Prevention of anti-CD3monoˉ clonal antibody-induced thymic apoptosis by protein tyrosine kinase inˉhibitors.J Immunol，1994，153（8）:3457-3465.
4 HarlowED.Antibodies a laboratory manual.NewYork:Cold Spring Haˉbor Laboratory，1988，615.
5 Ahmad Pazitanfeh，Yintong Xue.Paracrine glucocorticoid activity proˉduced by mouse thymic epithelial cells.FASEB J，1999，13:893-901.
6 Tronche F，Kellendonk C，Reichardt HM，et al.Genetic dissection of glucocorticoid receptor function in mice.Curr Opin Genet Dev，1998，8（5）:532-538.
7 Judson A，Brewer，Osami Kanagawa，et al.Thymocyte Apoptosis Inˉduced by T Cell Activation Is Mediated by Glucocorticoids In Vivo J.Immunol，2002，169:1837-1843.
（收稿日期:2004-06-08）
ˇ 基金项目:国家自然科学基金项目（批准号:30100164）
作者单位:100083北京大学医学部免疫学系
（编辑守 中）