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Yu Lu，Luo Huilan
Department of Kidney，305Hospital of People Liberation Army，Beijing100017.
【Abstract】 Objective To research the interaction of the simution fling centrifuge training with the new secˉond message-endogenous carbon monoxide and its synzyme heme oxygenase-1in primary culture rabbit vascular enˉdothelial cell.Methods Reverse transcription-polymerse chain reaction，dot blot and some biochemical index marks were performed so as to research the interaction of the simution fling centrifuge training with endogenous carbon monoxide and his synzyme heme oxygenase-1.Results The simution fling centrifuge training can incite the express of heme oxygenase-1mRNA and increase the concentration of endogenous carbon monoxide and incite the express of ET-1mRNA.After adding hemin，there are remarkable increase of the express of hene oxygenase-1mRNA，heightenˉing the concentration of endogenous carbon monoxide and cGMP.It would reduce the express of ET-1mRNA.Conˉclusion Heightening the express of heme oxygenase-1mRNA and the concentration of endogenous carbon monoxide can reduce the express of ET-1mRNA.
Key words heme oxygenase-1 endogenous carbon monoxide the simution fling
有研究报道，我国飞行人员30岁组动脉硬化指数达到一般人群40～50岁的水平，提示冠心病发病时间可能提早10～15年 ［1］ 。现代高性能战斗机具有持续高加速度、高G增长率等特点，对飞行员身体要求几乎达到机体的生理极限，飞行也是导致飞行员动脉粥样硬化的因素之一，近年来研究发现内源性一氧化碳（CO）是一种新型的信使分子，作为CO的限速酶和关键酶，即血红素氧化酶（HO）已被证实几乎分布于所有器官和组织。我们在以往的实验中发现CO与HO-1mRNA在整体动物动脉粥样硬化发病中有明显作用 ［2］ 。但在飞行过程中飞行员CO与HO-1mRNA是否发生变化及变化机制目前尚无研究。离心机是在地面模拟飞行中持续加速度的专用设备。可以准确控制G值、增长率和作用时间及模拟空战动作的G模式，我们把兔放在离心机模拟飞行，然后将兔主动脉内皮细胞进行原代培养，以探讨飞行对主动脉内皮细胞CO与HO-1mRNA的作用，及其在飞行员动脉粥样硬化发病中的可能机理。
1 动物分组及处理
1.1 动物分组 新西兰纯种兔，雄性，体重1.0～1.5kg，由第三军医大学动物所提供。随机分为对照组（未离心，n=10）和模拟飞行组（n=15）。模拟飞行组从+7Gz，45s开始离心，每天增加+0.5Gz，第11天增加到+12Gz，45s，第12天重复1次，第13天采用T型G模式检查+Gz耐力，增长率平均为+1Gz/s，每次增加+2Gz，暴露G值从12Gz开始，达到预定G值后恒速45s，然后下降，两次旋转之间休息5min，依次递增，直到耐受终点，即动物出现心跳减少到正常的一半。两组均在同一条件下饲养，各组均在第13天离心后，按陈氏 ［3］ 的兔主动脉内皮细胞培养方法，应用原代细胞进行培养。
1.2 细胞实验分组 （1）对照组:未离心兔原代主动脉内皮细胞;（2）模拟飞行组:离心兔原代主动脉内皮细胞;（3）模拟飞行+Hemin（氯化高铁血红素）组:即在离心兔原代主动脉内皮细胞中，分别再加入Hemin5μmU6h、12h的培养的兔原代主动脉内皮细胞。
1.3 RT-PCR测定培养兔原代主动脉内皮细胞mRNA表达 ［4］ 按宝灵曼公司的总RNA纯化试剂盒方法分别提取各组培养细胞的RNA。反转录聚合酶链式反应:采用随机引物法，反转录用聚合酶链式反应试剂盒（Boehringer Mannheim）。聚合酶链式反应扩增HO-1和β-肌动蛋白（β-actin）特异性片段。扩增HO-1cDNA特异性片段的引物是根据Toshisuke发表的HO-1特异性引物的序列 ［3］ 确定的。上游引物为5′-GAATTCAGCATGCCCCAGGATGGT-3′，下游引物为5′-TCTAGACTAGCTGGATGTTGAGCAGGA-3′。在进行RT-PCR的同时扩增鼠β-actin用作内参照，保证每次实验的相对可比性，扩增鼠β-actin特异性片段的上游引物为5′-GCG GGA AAT CGT GCT ACA TT-3′，下游引物为5′-GAT GGA GTT GAA GGT AGT TTC GTG-3′。按常规方法进行PCR，94℃1min，50℃1min，72℃1min。首轮循环95℃2min，最后72℃延伸5min，共进行30次循环。然后进行1%琼脂糖电泳分析。
1.4 兔原代主动脉内皮细胞HO活性变化研究 ［5］ 分别取各组培养细胞测HO活性，空白管为正常培养基。将细胞悬浮于缓冲液中。离心后将上清加入反应混合液中，然后避光反应1h，被提炼的胆红素根据在464mm和530nm处的吸光度而被推算出，胆红素消退系数为40mM -1 ·cm -1 。HO活性单位是:pmol/mg·pr/h。蛋白定量采用考马斯亮蓝法。
1.5 兔原代主动脉内皮细胞CO含量变化研究 ［6］ 分别取各组培养细胞测CO含量，空白管为加正常培养基，取细胞破膜液0.2ml，空白管加双蒸水0.2ml。每管加入2ml血 红蛋白溶液混匀。每管加入0.1ml连二亚硫酸钠溶液混匀后静置10min。以空白管为对照，721A型分光光度计测OD 541 和OD 555 。
1.6 兔原代主动脉内皮细胞cGMP含量变化研究 ［7］ 收集培养各组及各时相点血管内皮细胞，离心后弃上清，每管加入0.5ml双蒸水，加入预冷的HClO 4 混匀，离心10min，取上清0.5ml至另一离心管，加入KOH，混匀后离心，取上清置-20℃保存。cGMP测定按 125 I标记试剂盒说明书进行。含量单位以pmol/L表示。
1.7 兔原代主动脉内皮细胞ET-1mRNA的斑点杂交 ［8］ 取适当的NC膜进行处理，再取保存的总RNA8μl，加变性稀释液。依次取各时相点总RNA、ET-1cDNA及血红素氧化酶-1cDNA质粒各2μl点样于NC膜小方格的中央，烤膜，65℃预杂交20h。后加入2.5ml杂交液中，置42℃杂交18～20h。多次漂洗后加地高辛抗体，使抗体1:50000稀释，37℃，45rpm摇动30min。加新配制显色液，间断观察显色情况。待显色满意后终止显色反应，拍照。图像分析:测定各点积分光密度值。
1.8 统计学方法 实验数据以均数±标准差表示，采用Microsoft Excel97数据分析统计程序进行单因素方差分析及部分指标相关分析。
2 结果
兔原代主动脉内皮细胞HO-1mRNA表达、HO活力、CO浓度、cGMP含量及ET-1mRNA表达变化，见表1。
表1 内皮细胞HO-1mRNA、ET-1mRNA表达图像分析、HO活力、CO浓度及cGMP含量变化 （略）
注:与前一时相点相比 ˇ P<0.01，单位:cGMP含量（pmol/L）、CO（μg/mg）、HO酶活力（pmol bilirubin/mg·pr/h）
模拟飞行组HO-1mRNA的表达与对照组相比有所增加;而模拟飞行+Hemin6h组与对照组和单纯刺激组相比HO-1mRNA表达有非常明显增加;模拟飞行+Hemin12h组与加Hemin6h组相比HO-1mRNA的表达有非常明显增加。而β-actin mRNA的表达在各组之间表达量无明显变化（P均<0.01）。（见图1）。培养血管内皮细胞的模拟飞行组HO的活性较对照组有非常明显增高;而模拟飞行+Hemin6h组HO活性比模拟飞行组有非常明显增高;模拟飞行+Hemin12h组HO活性比模拟飞行+Hemin6h组有非常明显增高（P均<0.01）。
培养主动脉内皮细胞模拟飞行组CO含量比对照组有非常明显的增高;模拟飞行+Hemin6h组CO比模拟飞行组有非常明显的增加;模拟飞行+Hemin12h组比模拟飞行+Hemin6h组有非常明显的增加，P均<0.01，相关分析表明:CO的浓度的增高与HO活性增高呈非常显著的正相关（r=0.999331，P<0.01）。培养血管内皮细胞模拟飞行组 cGMP含量比对照组有明显的增高;模拟飞行+Hemin6h组cGMP含量比模拟飞行组有非常明显的增加;模拟飞行+Hemin12h组比模拟飞行+Hemin6h组有非常明显的增加（P均<0.01），模拟飞行组cGMP含量的增高与CO的浓度的增高呈显著的正相关（r=0.943925，P<0.05）。实验中也观察到培养血管内皮细胞模拟飞行组比对照组ET-1mRNA的表达呈非常显著的增高，模拟飞行+Hemin6h组比模拟飞行组的ET-1mRNA的表达呈非常显著的降低。模拟飞行+Hemin12h组比模拟飞行+Hemin6h组的ET-1mRNA的表达呈非常显著的降低（见图2），从以上结果来看模拟飞行能非常显著地增高培养内皮细胞ET-1mRNA的含量，而在加入Hemin后ET-1mRNA的表达逐渐减少，表明Hemin可能通过某种机制减少ET-1的产生。
3 讨论
内源性一氧化碳是一种新的第二信使，而作为血红素代谢中的限速酶HO-1，能降解血红素为胆绿素、铁离子和一氧化碳。目前研究发现HO-2主要在正常生理状态下发挥作用，而HO-1不仅在正常生理状态下发挥着调节作用，还在机体应激及疾病状态中发挥着作用 ［9］ 。因此在疾病状态下研究HO-1mRNA变化，意义更大。
我们在动物实验通过免疫组化染色和原位杂交研究发现HO-1主要存在于主动脉内皮细胞层 ［10］ ，仅在动脉粥样硬化的晚期HO-1蛋白在主动脉平滑肌细胞出现明显阳性反应。并且发现随着主动脉壁内皮和内皮下动脉粥样硬化病变逐渐加重，HO-1的mRNA的表达和HO-1的蛋白表达呈动态进行性增强的变化发展趋势。1998年5月Wang应用原位杂交方法在人和动物体内研究了HO-1在动脉粥样硬化损伤部位的分布状态，发现HO-1mRNA主要分布于内皮细胞层和损伤部位增厚内膜的泡沫细胞/巨噬细胞 ［11］ 。
在动脉粥样硬化的进展是多因素导致的，研究发现在飞行员中，飞行是导致其动脉粥样硬化的重要因素之一。我们研究观察到模拟飞行组能促使HO-1mRNA表达明显增高，随着HO-1mRNA的增高，HO-1活性也增高，并且模拟飞行的这种作用在将细胞用Hemin处理后，培养主动脉内皮细胞HO-1mRNA表达增加更为显著。目前研究也发现亚铁血红素的降解产物胆绿素和胆红素是抗氧化剂，在哺乳动物中胆绿素是由胆绿素还原酶降解的 ［12］。以前的研究表明胆绿素和胆红素具有抑制亚油酸和LDL氧化的能力，它们的抗氧化能力比α-生育酚要强 ［13］。目前HO-1已被认为参与机体抗氧化损伤的保护机制中 ［14］ 。因此由模拟飞行诱导HO-1mRNA表达增高，从而导致胆绿素和胆红素增高，对机体产生抗氧化作用，这可能是机体的一种自我调节作用。
我们在实验中发现模拟飞行能非常明显的增强培养血管内皮细胞ET-1mRNA的表达，而加入Hemin刺激后各组培养血管内皮细胞的HO-1mRNA表达、HO-1活性、cGMP的含量明显增高。同时培养内皮细胞的ET-1mRNA的表达逐渐降低。内皮素（ET）是目前所发现作用最强的血管收缩肽。我们在实验观察到模拟飞行能明显地刺激培养的血管内皮细胞ET-1地产生。ET与心血管疾病的病理生理变化有密切的关系。在动脉粥样硬化的发展过程中大鼠肠系膜动脉、主动脉及冠状动脉的内膜，发现ET-1mRNA表达增强。由于ET是机体在某些病理状态下产生和释放的一种重要的致病因子，因此抑制ET的产生可能达到治疗疾病的目的。我们在实验中观察到Hemin通过增高HO-1mRNA的表达，使CO产生增多，使cGMP的含量增高，降低由模拟飞行引起的ET的含量增高。1995年Toshisuke也报道CO是cGMP的刺激物，cGMP增多抑制ET的产生 ［15］ 。这与我们的观察是一致的。 从以上研究我们可以看出:飞行可能会导致主动脉内皮细胞ET-1mRNA表达增强，从而导致包括动脉粥样硬化等疾病的进展，而通过外源性的因素促进HO-1mRNA表达增强，使CO产生增多，cGMP的含量增高，降低由飞行引起的ET的含量增高，从而达到保护或减缓动脉粥样硬化的发展的作用。
（本文图片见封三）（略）
参考文献
1 张相尧.中华医学会航空医学会心血管专题研讨会纪要.航空军医，1998，26（2）:14-16.
2 喻陆，何作云.实验性兔动脉粥样硬化发病过程中内源性一氧化碳及其合成酶基因表达改变的研究.中国动脉硬化杂志，1999，7（2）:95-99.
3 陈云波，王奇，王培训，等.血淤证兔模型血管内皮细胞培养的形态结构改变.中国中医基础医学杂志，1999，5（5）:12.
4 卢圣栋.现代分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社，1993，2.
5 Toshisuke M，Perrella MA，Lee ME，et al.Smooth muscle cell-deˉrivered carbon monoxide is a regulator of vascular cGMP.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92:1475-1479.
6 Ohkawa H.Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituuric acid reaction.Anal Biochem，1979，95:3551.
7 莫启忠，方军，宫斌，等.125I标记环磷酸腺苷的放射免疫测定法.核技术，1986，9:43.
8 Noiri E，Kuwata S，Nosaka K，et al.Tumor necrosis factors mRNA exˉpression in lipopolysaccharide stimulated rat kidney.Am J Path，1994，144:1159.
9 Marks QS，Brien JF，Nakatsu K，et al.Does carbon monoxide have a physiological function?Tends Pharmacol Sci，1991，12:185-188.
10 喻陆，何作云.内源性一氧化碳合成酶-1在体内分布状态.第三军医大学学报，1998，20（5）:449.
11 Wang LJ，Lee TS，Pai Rc，et al.Expression of heme oxygenase-1in atherosclerotic lesions.Am J Pathol，1998，152（3）:711-720.
12 Balla J，HS Jacob，S Balla，et al.Endothelial-cell heme uptake from heme protein:induction of sensitization and desensitization to oxidant damage.Pro Natl Acad Sci USA，1993，90:9285-9289.
13 Neuzil J，Stocker R.Free and albumin-bound bilirubin are efficient co-antioxxidants for alpha-tocopherol inhibiting plasma and low-denˉsity lipoprotein lipid peroxidation.J Biol Chem，1994，269:16712-16719.
14 Otterbein L，Sylvester SL，Choi AMK.Hemoglobin provides protection against lethal endotoxemia in rats:the role of heme oxygenase-1.Am J Respir Cell Mol Biol，1995，13:595-601.
15 Toshisuke M，Stella K.Endothelial cell expression of vasoconstrictors and growth factors are regulated by smooth muscle cell-derived carbon monoxide.J Clin Invest，1995，96:2676-2682.
（收稿日期:2004-08-09）
ˇ 基金项目:国家自然科学基金赞助课题（批准号:39800065）;军队十五课题基金赞助（批准号:OMA063）
作者单位:100017北京解放军第305医院肾脏病血液净化中心
空军总医院心内科
（编辑刘 静）