乳腺癌中ER和PR一致性表达的研究

    【摘要】 目的  用免疫组化法研究乳腺癌中雌激素受体和孕激素受体的一致性表达。 方法  用PV-9000两步法分别检测55例乳腺癌标本中ER和PR;并用图像分析仪测定未复染病例免疫复合物含量;并计数苏木素复染病例的阳性细胞百分率。探讨ER和PR在阳性表达率、免疫复合物含量和阳性细胞百分率之间的关系。 结果  ER和PR在阳性表达率方面存在一致性表达;并且ER和PR的免疫复合物含量和阳性细胞百分率有直线相关和回归关系。 结论  ER和PR在阳性表达率、免疫复合物含量和阳性细胞百分率三个方面均存在一致性表达。
      
　　    
　　The research on ER/PR consistency express in breast cancer
     
　　Wu Weijiang，Li Zhihua，Xia Chaoyong，et al.

    The People's Hospital of Longchuan County，Guangdong517300.   
     
　　【Abstract】 Objective To explore ER/PR consistency express in breast cancer with immunohistochemistry staining.Methods Immunohistochemistry staining of ER and PR in55breast cancers was carried out by PV-9000two step method，and the content of ER/PR immunocomplex in non-restaining cases was assayed by image analyzer，at the same time，the percentage of positive cells of restaining cases by hematoxylin was calculated.The relation of ER and PR was explored in positive expression，percentage and immunocomplex content.Results ER was in concordance with PR in positive expression.There was linear correlation and regression relation between ER/PR content and the percentage of ER/PR positive cells.Conclusion ER was in concordance with PR in positive expression，percentage of positive cells and immunocomplex content.
     
　　Key words breast cancer estrogen receptor progestogen receptor immunohistochemistry consistency
      
　　大量研究 ［1～4］ 发现，正常乳腺组织中即存在着极少量的雌激素受体（Estrogen receptor:ER）和孕激素受体（Proges-terone receptor;PR），它们是具有高度亲和力的蛋白质;ER是细胞接受信息的一种装置，在细胞间的信息传递过程中发挥着重要作用，与雌激素（主要是雌二醇）形成一种具有活性的ER复合体，该复合体与所调控的DNA基因的特定部位结合，然后启动转录，以诱导合成特异性蛋白质，并通过该蛋白表现出激素的生理作用;而PR是雌二醇和ER结合诱导的产物，PR的存在反映了ER的结构和功能均正常。而且研究 ［5，6］ 已经证明，ER和PR均阳性的乳腺癌病人对内分泌治疗的敏感性，比ER和PR单独阳性或均阴性的患者要敏感;而且五年生存率明显升高。因此，对乳腺癌病人ER和PR联合免疫组化检测，用来辅助内分泌治疗和判断预后在临床应用中逐渐展开。本实验在ER和PR阳性表达率、免疫复合物含量和阳性细胞百分率三个方面对ER和PR的一致性表达进行研究。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 材料 收集我院原发性乳腺癌根治手术标本55例，患者均女性，年龄22～86岁，平均年龄47.78岁。患者术前均做过抗肿瘤治疗，病理资料完整，标本经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片。
     
　　1.2 试剂和方法 一抗:ER和PR鼠抗人为美国NEO-MARKERS公司生产，两步法免疫组化检测试剂盒及DAB酶底物显色试剂盒购自北京中山公司。

    染色采用PV-9000两步法，操作步骤按试剂盒说明进行，组织切片均进入10mmol/L柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）进行修复，中高火辐射15min，分别滴加一抗（ER、PR浓度均为1:100）后4℃冰箱过夜;DAB显色显微镜下观察控制，苏木精不进行复染，常规脱水透明封片，如图1～2所示。用已知乳腺癌阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.3 对ER/PR阳性病例进行免疫复合物定量分析 用TIGER细胞图像分析仪，40×（NA0.5）物镜下，随机抽取每一例ER/PR阳性未复染病例10个视野，总共不少于500个细胞，测定被抽取的每一个细胞核的平均光密度、核体积、核面积等参数;并将平均光密度与对应的同一例标本8μm切片用TIGER细胞图像分析仪所测的平均体积 ［7，8］ 进行积分，从而得到每一例ER或PR阳性病例免疫复合物的体积积分光密度（volume integrated optical density:VIOD）。

    1.4 计数乳腺癌ER/PR阳性已复染病例的阳性细胞百分率 将已经进行定量分析的ER/PR切片重新苏木精复染（将切片浸入二甲苯中约24h，直至盖玻片自动脱去，经无水乙醇、95%酒精、90%酒精、80%酒精和70%酒精各5min，苏木精复染分色后，常规脱水、透明和中性树胶封片），如下图3～4所示。
   
　　以国际公认的系统随机抽样的方法，通过计数整个待测癌巢或肿瘤区域内所有的肿瘤细胞来计算其阳性细胞百分率:400×光镜下进行观察，从左上角第一个完整的可计数视野开始，横向自左向右，每间隔一个视野抽取一个观测视野，直到此横行的最后一个可计数的视野，再转到下一行，从右到左如此循环进行，逐行交替间隔的抽取视野;每一个选中的视野经彩色摄像头采图后显示在纯屏显示器上，以此图像作为实际观测对象;把无偏计数框网络胶膜贴在显示屏上逐格逐行进行阳性细胞记数，测定每例标本的ER、PR的阳性细胞百分率（出血、坏死、受挤压的组织及切片边缘不应作为计数组织）。
   
　　1.5 结果判断 ER、PR阳性细胞判断:癌细胞核中出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞在所有肿瘤细胞中所占的百分比分为两个等级;无阳性细胞或阳性细胞百分比<5%为肿瘤ER/PR阴性表达，>5%则为肿瘤ER/PR阳性表达。
   
　　1.6 统计学方法 采用SPSS10.0软件包进行统计学处理与分析，主要采用卡方检验、直线相关和回归分析。

　　2 实验结果
    
　　2.1 乳腺癌中ER表达与PR表达的关系 对55例乳腺癌标本中ER、PR的一致性表达进行了研究，如表1所示，经配对资料卡方检验，P=0.049<0.05，故认为ER与PR存在一致性表达的关系。
    
　　表1 乳腺癌中ER与PR一致性表达的关系略
    
　　2.2 乳腺癌中ER和PR免疫复合物含量的相关性研究 测定了ER和PR均阳性的25例病例对应的免疫复合物含量（VIOD），并对二者进行直线相关和回归分析。Pearson Correlation=0.797，P=0.000，按α=0.05检验标准，拒绝H 0 ，可认为ER和PR免疫复合物的含量呈正的直线相关关系。对其进行直线回归分析，可见ER和PR免疫复合物的含量的散点图呈直线趋势，随着ER含量的增加，PR含量亦随之增加，如图5所示，决定系数R 2 =0.636，回归系数t检验的t=6.337，P=0.000，可认为ER与PR免疫复合物含量之间有直线关系，直线回归方程为:Y=0.618X+28.122，总体回归系数95%可信区间为0.368～0.775。
   
　　2.3 乳腺癌中ER和PR阳性细胞百分率之间的相关性研究 对所测阳性病例的ER和PR的阳性细胞百分率进行计量资料的秩和检验，ER的阳性细胞百分率平均为56.67%，PR的阳性细胞百分率平均为47.78%，统计量Z=-1.78，P=0.045，因此认为ER和PR的阳性细胞百分率差异有显著性，ER比PR的阳性细胞百分率要高。
   
　　进一步对ER和PR同时表达的25例病例的阳性细胞百分率进行相关和回归分析，Pearson Correlation=0.588，P=0.001，按α=0.05检验标准，拒绝H 0 ，可认为ER和PR阳性细胞百分率呈正的相线相关关系。对其进行直线回归分 析，可见ER和PR阳性细胞百分率的散点图呈直线趋势，随着ER阳性细胞百分率的增加，PR阳性细胞百分率亦随之增加，如图6所示:决定系数R 2 =0.346，回归系数t检验的t=3.490，P=0.002，可认为ER与PR阳性细胞百分率之间有直线关系，直线回归方程为:Y=0.656X+3.989，总体回归系数95%可信区间为0.267～1.045。
　　
　　3 讨论
    
　　乳腺癌中ER和PR一致性表达的阳性率文献报道不一，耿翠芝等 ［9］ 对1393例乳腺癌病人研究发现，ER和PR呈高度正相关性，PR的阳性率随着ER阳性率升高而升高。本实验在ER和PR的阳性表达率、免疫复合物含量和阳性细胞百分率三个方面进行了一致性表达的研究，发现二者之间有明显相关性，ER和PR在阳性表达率方面存在一致性表达，而且PR的免疫复合物含量和阳性细胞百分率均随着ER的增高而增高，即ER和PR存在直线相关和回归关系。严航等 ［4］ 报告100例乳腺癌雌、孕激素测定结果:ER（+）与PR（+）为66%，ER（+）与PR（-）为6%，ER（-）与PR（+）为14%，ER（-）与PR（-）为14%;而本实验的ER（+）PR（+），ER（+）PR（-），ER（-）PR（+）和ER（-）PR（-）分别为45%，20%，20%和15%;由此可见在检测过程中仍然有ER和PR不一致表达的现象，PR是在雌激素与ER结合后形成的复合物诱导下合成的，PR出现显示ER功能机制的完整性;ER（+）PR（-）可能为ER功能链上的脱节，而ER（-）PR（+）则可能为免疫组化检测技术过程的误差，也不排除存在另一中尚未被目前所认识的PR合成机制;临床上有必要对ER和PR进行同时检测。（本文图片略）
     
　　参考文献
    
　1 Dinegen WL.Prognostic factors.Cancer，1992，70（6suppl）:1755-1764.

    2 Brookssc，Saunders DE，Singhakowinta A.Relation of tumor conternt of estrogen and progesterone receptor with response of patients to endocuine therapy.Cancer，1980，46（12suppl）:2775-2778.

    3 Wittliff JL.Steroid-Hormone receptor in breast cancers.Cancer，1984，53（3suppl）:630-643.

    4 严航，苏宁，史志英.100例乳腺癌雌激素受体和孕激素受体测定和分析.肿瘤，1999，19（2）:107-108.

    5 ATsuchiya，MNihei.The relationship of estrogen receptor status to DNA ploidy in breast cancer.Surg Today，January1，1992，22（20）:105-109.

    6 M Rudas，R Neumayer M.F.X Gnant，MMittelbock，R Jakesz，A Rein-er.p53Protein Expression，Cell Proliferation and Steroid Hormone Re-ceptors in Ductal and Lobular In Situ Carcinomas of the Breast.Euro-pean Journal of Cancer Part A.January，1997，33（1）:39-44.

　7 Gundersen HJG.The nucleator.J Microsc，1988，151:5-6.

    8 Gundersen HJG，Bagger P，Bendtse FT.The new sterological tools:Dis-ector fractionator and point sampled intercept and their use in pathologi-cal research and diagnosis.APMIS，1988，96:857-860.

    9 耿翠芝，吴祥德，王小玲，等.1393例乳腺癌雌、孕激素受体状况分析.中国肿瘤临床，2002，29（11）:793-796.    

　　作者单位:1　517300广东省龙川县人民医院（△ 暨南大学在读硕士研究生）
  
　　　　　　 2　510630暨南大学医学院组织胚胎学教研室

    （收稿日期:2004-08-01）