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The effect of benazepril on podocin in glomerulus of adriamycin-induced nephropathic young rats
Hu Xu，Lu Ling，Wan Mingli，et al.
Department of Pediatrics，the People's Hospital of Liu′an City，Anhui237005..
【Abstract】 Objective To approach the localization of podocin in glomerulus and its possible role in protein-uria occuring in nephropathic syndrome as well as the effect of benazepril on its density in glomerulus so as to study the possible mechanism of prednisone and benazepril in treating NS.Methods 24young SD rats（1-month-old，weighing around150g）were chosen in this experiment，16rats as the nephropathic group were injected with adriamycin（5mg/kg）via tail-vein for one time，and the other8rats as the normal-control group were injected with0.9%saline.Two weeks after the injection，the excretion of24hours urinary protein of all rats was detected and those with24hours urinary protein>30mg were chosen as nephropathic rats.All nephropathic rats were further randomly divided into2groups:nephropathy-control group（n=8），benazepril-treated group（n=8）.Benazepril-treated rats were administrated with benazepril3mg·kg -1 ·d -1 respectively，the normal-control rats and nephropathy-control rats were administrated with0.9%saline.Four weeks later urinary protein were measured and meanwhile all rats were killed and their renal cortex were taken for localization and semi-quantitive analysis of podocin.Results （1）podocin was distributed at the base of the podocyte foot processes near the GBM.It was primarily located at the cyto-plasmic face of the plasma membrane adjacent to the filtration slits.Small clusters of particles of podocin were occa-sionally found along the surface of the foot processes at a distance from the GBM.No significant labelling was observed on the GBM or the podocyte cell bodies.No labelling was detected on Bowman's capsules，endothelial or mesangial cells.（2）At the end of the experiment，we gain optical density（A）of each group through Metaphorgh as following:normal-control group:0.298±0.0414;nephropathy-control group:0.562±0.0375;benazepril-treated group:0.427±0.0323.Compared with the nephropathy-control group，optical density was significantly different（F=77.56，P<0.001）.The staining intensity of podocin decreased prominently in nephropathic samples compared with normal-control group while the staining intensity of podocin increased in benazepril-treated samples compared with untreated nephropathic samples.Conclusion Podocin is a major component of the slit diaphram;the concentration of podocin decreased prominently in nephropathic samples;it is possible that benazepril reduce the excretion of urine protein by affecting the intensity of podocin in the glomerulus.
肾病综合征（Nephrotic Syndrome NS）是儿科常见的疾病，病因至今未明。肾病综合征以大量蛋白尿、水肿、低蛋白血症和高脂血症为主要临床特点，而大量蛋白尿是最关键的病理生理改变，病理上以肾小球上皮细胞足突广泛融合为主。蛋白尿的发生、足突融合的机制及两者间的关系正成为国内外学者研究的热点。这主要是由于近年来两个新基因NPHS1和NPHS2及其编码的蛋白nephrin和podocin的发现。这两个基因的突变均会导致肾小球裂孔隔膜相应蛋白表达的异常，从而导致大量蛋白尿的发生 ［1，2］ 。治疗方面，目前肾病综合征尚无特效的治疗方法，血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）减轻蛋白尿的具体机制尚不完全清楚。本研究应用免疫组织化学方法（免疫荧光、胶体金标记免疫电镜）定位及半定量分析研究肾组织中足细胞蛋白podocin在正常幼年大鼠和阿霉素肾病幼年大鼠的异同，以及苯那普利对此蛋白浓度和定位的影响以探讨podocin在肾病综合征蛋白尿发生中的可能作用以及ACEI减轻蛋白尿的可能机制。
1 材料与方法
1.1 大鼠阿霉素肾病模型制备及分组 4周龄、体重150g左右的SD幼年雄性大鼠24只（由上海BK公司提供），其中16只予尾静脉单次注射阿霉素5mg/kg制备阿霉素肾病模型，8只仅注射等量生理盐水为对照组。于注射后2周测所有大鼠24h尿蛋白定量，24h尿蛋白定量>30mg为肾病模型成功 ［3］ ，而不合格者予以剔除。随机将16只肾病大鼠分为肾病对照组8只和肾病苯那普利治疗组8只。苯那普利治疗组给予苯那普利3mg·kg -1 ·d -1 溶于1ml生理盐水中灌胃，肾病对照组及正常对照组以等量生理盐水灌胃 ［4］ 。
1.2 免疫荧光染色半定量分析各组大鼠肾组织podocin蛋白表达 用冰冻切片机将肾皮质组织制成厚约4～5μm的冰冻切片。免疫荧光染色前先让组织标本自然干燥10min后将切片浸入丙酮固定5～10min，而后用0.01MPBS清洗3次，每次5min;在室温下滴加未标记的第一抗体兔抗人podocin多克隆抗体（法国Corrine Antignac教授惠赠），然后置湿盒中孵育30min（为减少背景干扰，滴加一抗前用小牛血清封闭）;PBS缓冲液洗涤3次，边洗涤边振荡，每次5min;拭净切片周围的液体，滴加荧光标记的第二抗体（FITC-羊抗兔IgG）并置室温下1h;PBS缓冲液（0.15mol/L，pH7.6）震荡漂洗3次，每次3min;PBS缓冲液（0.01mol/L，pH7.5）震荡漂洗1min以洗净未结合的荧光标记物;拭净切片周围的液体，封片待检。封片液为甘油-PBS混合液。置荧光显微镜下镜检，最后将图像采集收入计算机进行半定量分析。（注:各观察对象的各次切片均同时以磷酸缓冲液代替一抗作空白对照）
1.3 免疫电镜进行podocin的定位分析 首先将新鲜肾组织标本立即放入1%多聚甲醛固定液中，并置入4℃冰箱中初固定，初固定4h后2%戊二醛再固定，然后在脱水和包埋后用切片机制成1μm的半薄切片，以0.5%甲苯氨蓝溶液染溶液染5min，在光镜下选取病变之处，之后将包埋块切成表面积为0.3mm×0.2mm的锥体状，应保证所选病变区包含在所留组织内。最后用超薄切片机制成超薄切片，并置于镍网的火棉胶薄膜上。在室温下滴加未标记的第一抗体（兔抗podocin）后4℃过夜;PBS缓冲液洗涤3次，每次5min;滴加胶体金颗粒标记的羊抗兔抗体，并置室温下1h; PBS缓冲液漂洗3次，每次3min;5%醋酸铀水溶液染色，水洗:枸橼酸铅染色后封片、镜检。
1.4 统计学方法 采用计算机统计软件（SPSS10.0）对所有数据进行分析
2 结果
2.1 大鼠24h尿蛋白检测结果及分析 ADR注射前，正常对照组与分为肾病组的大鼠24h尿蛋白定量结果比较差异无显著性，尿蛋白定性均为阴性。实验4周时，3组大鼠蛋白尿标本检测结果见表1。肾病各组尿蛋白排出量均高于正常对照组，而苯那普利治疗组尿蛋白排出量较肾病对照组明显减少，差异均有非常显著性（P<0.01）。
表1 实验4周时各组大鼠24h尿蛋白检测结果（略）注:与正常对照组相比， △ P<0.01，与肾病对照组相比， * P<0.01
2.2 各组肾组织免疫荧光染色半定量结果 见图1～3。实验4周时各组大鼠肾组织podocin免疫荧光染色结果表明荧光染色部位为肾小球，而肾小管和肾间质均没有染色。各组每只大鼠肾皮质标本切片5张，随机选取一张进行免疫荧光组织化学染色后，在200倍视野并在同样区域随机摄片，然后通过Metaphorph图像分析系统获取吸光度值（A）并用SPSS10.0进行统计学处理。（注:免疫荧光强度与吸光度成反比）结果见表2。阿霉素肾病幼鼠肾组织中podocin表达浓度较正常对照组明显减少，P<0.001，而经过苯那普利干预治疗后podocin浓度较肾病对照组明显增加，P<0.001;差异有非常显著性。
表2 实验4周时各组大鼠肾组织podocin（略）注:与正常对照组比较 * P<0.001;与肾病对照组比较 △ P<0.001
2.3 胶体金标记免疫电镜podocin定位结果 见图4～6。podocin分布在靠近GBM的足突基底部，主要定位于裂隙隔膜的胞质面，部分金颗粒也可发现与GBM稍远的足突细胞表面，而在GBM、内皮细胞、系膜、包曼囊或肾小管均没有表达迹象;阿霉素肾病肾组织肾小球中足突广泛融合但免疫胶体金颗粒几乎见不到;苯那普利治疗后金颗粒增加，足突融合改善。（本文图片见封三）
3 讨论
Podocin蛋白具有383个氨基酸，分子量约为42kDa，属于内在膜蛋白（integral membrane protein）其短的单一膜内结构域105～121位氨基酸在膜内形成“发夹”样结构而它的N-端和C-端结构域则位于细胞质内。podocin是由NPHS2基因编码，是一种stomatin家族的新成员，在人胚肾和成熟肾肾小球局部高表达。NPHS2基因位于人类染色体1q25-q31区域的NPHS2基因的突变导致了常染色体隐性遗传激素耐药肾病综合征（Autosomal Recesessive Steroid-resistent Idiopathic Nephrotic Syndrome SRINS）的发生。该基因有8个外显子，编码足突细胞Podocin蛋白 ［2，5］ 。大量蛋白尿是NS最关键的病理生理改变，病理上以肾小球上皮细胞足突广泛融合为主。探讨蛋白尿发生、足突融合的机制及两者间的关系对研究大量蛋白尿的发生机制具有重要意义。大量蛋白尿的发生主要取决于肾小球的滤过和肾小管的重吸收，其中肾小球的滤过功能最为重要，肾小球的滤过屏障分3层，内层为带孔的毛细血管内皮细胞，中层为基底膜，外层为足突上皮细胞足突之间的裂孔隔膜。裂孔隔膜是蛋白滤过的最后一道屏障，也是最关键的一道，然而关于裂孔隔膜的分子组成及结构一直不明确，阻碍了人们对蛋白尿形成机制的认识。本研究运用免疫电镜显示podocin分布在肾小球上皮细胞足突基底部，主要定位于裂隙隔膜的胞质面，部分金颗粒也可发现与GBM稍远的足突细胞表面，而在GBM、内皮细胞、系膜、包曼囊或肾小管均没有表达迹象，与Severine ［5］ 所报道的基本一致。Luimula P ［6］ 等曾用免疫荧光组织化学染色方法发现在大鼠嘌呤霉素肾病模型肾组织中有podocin表达浓度的减少。我们用同样方法发现在阿霉素肾病幼鼠肾组织中podocin表达浓度也较正常对照组明显减少，而经过苯那普利治疗后浓度明显增加同时蛋白尿减轻。这说明podocin对于维持肾小球滤过膜通透性完整至关重要。Podocin减少导致肾病幼鼠肾小球滤过膜不完整从而发生大量蛋白尿。另外，苯那普利治疗后的肾病大鼠肾组织中podocin表达浓度增加而蛋白尿减轻，进一步证实两者间的联系同时也说明苯那普利可能通过诱导podocin表达增加，使肾小球滤过膜的完整性得到一定程度的恢复而减轻蛋白尿。但两者如何使podocin表达增加尚待进一步深入研究。我们通过免疫电镜也发现在阿霉素肾病肾组织肾小球中足突广泛融合但金颗粒几乎见不到，说明阿霉素在体内导致足突消失同时伴有podocin在细胞表面分布的明显减少甚或消失。而干预治疗后podocin表达浓度增加时足突融合好转，提示podocin的破坏在足突融合中起重要作用，支持Schwarz K等 ［7］ 有关nephrin/podocin的破坏可能是导致蛋白尿疾病中足突融合的最后共同通路的推测。Tobias B等 ［8］ 研究证实podocin的正常表达对nephrin维持正常的结构和功能起关键作用，而nephrin是裂孔隔膜的重要蛋白，故在此我们可以推想阿霉素破坏podocin的同时可能将影响到nephrin的表达，而这两种足突细胞膜的关键蛋白成分的减少最终导致足突细胞结构塌陷融合及大量蛋白尿的发生。目前肾病综合征尚无特效的治疗方法，近年来ACEI在肾病治疗中的作用较为引人注目，但ACEI减轻蛋白尿的具体机制尚不完全清楚。Tanaka等 ［9］ 在肾功能不全伴大量蛋白尿的动物模型中发现，ACEI在短期内可迅速减少蛋白尿，认为与ACEI能使缓激肽（bradykinin，BK）积聚，从而更明显地降低了肾小球内压有关。然而Zoja等 ［10］ 则认为A-CEI降尿蛋白的作用完全与其抑制AngⅡ的活性相关，而不依赖于另外的激素系统（如BK）。亦有人报道ACEI可改善血管紧张素Ⅱ对系膜细胞的收缩作用，调节肾小球毛细血 管基膜的滤过孔径，影响肾小球基底膜的滤过屏障，从而降低蛋白尿的排泄 ［11，12］ 。本研究发现苯那普利干预治疗后使podocin表达浓度增加同时有蛋白尿减少，提示ACEI也可能通过影响肾小球滤过膜中podocin表达浓度而起到减轻蛋白尿的治疗效果。
总之，本实验运用免疫荧光染色及免疫电镜技术发现podocin为肾小球上皮细胞裂孔隔膜上的主要结构蛋白，其分布在靠近GBM的足突基底部，主要定位于裂隙隔膜的胞质面。podocin在阿霉素肾病幼鼠肾组织中的表达浓度减少甚至消失，而经过苯那普利干预治疗后浓度有所增加同时蛋白尿减轻说明podocin参与大量蛋白尿的形成机制，podocin表达减少或消失亦可能是导致肾小球足突细胞融合的关键因素。ACEI可能通过影响肾小球滤过膜中podocin表达浓度而减轻蛋白尿。在人类获得性肾小球疾病中特别与阿霉素肾病有相同病理改变的小儿肾病综合征患儿肾小球中podocin是否有相似的改变以及podocin与肾小球滤过膜中的其他多种蛋白分子间如nephrin、CD2AP、actin等的相互关系尚待进一步探讨。
参考文献
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作者单位:237005安徽省六安市人民医院儿一科
230030安徽医科大学第一附属医院儿科
安徽医科大学微生物教研室
安徽省立医院病理科