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高效液相色谱法测定细胞DNA中的碱基成分，有着广泛的应用前景，可用于细菌、病毒、真菌等微生物的核酸研究。它能对表型特性相似，临床生化反应相同，难以鉴别的细菌，尤其是对一个新菌种作出辅助鉴定 ［1］ 。本文对高效液相色谱测定DNA中碱基成分鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）的方法进行了研究，对部分细菌细胞DNA中的碱基成分进行了测定，现报告如下。
1 实验部分
1.1 仪器及工作参数 HP1100LC液相色谱仪，HP chemsta-tion色谱数据工作站，UV—可见紫外检测器，在线脱气;色谱柱:ODS C 18 Hypersil5μm250×4mm;流动相:甲醇（A）+0.02mol/L乙酸铵（B），梯度洗脱，见表1;检测波长254nm;柱温:室温;流速:1.0ml/min;进样量20μl。
表1 梯度洗脱（略）
1.2 试剂 甲醇:经滤膜（0.45μm）过滤;0.02mol/l乙酸铵溶液称1.54g乙酸铵，加水溶解并稀释至1000ml，经滤膜（0.45μm）过滤;鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）标准溶液:各称50.0mg，加磷酸2.5ml，加10ml水，加热至80℃溶解并用水稀至50.0ml，即成1.00mg/ml混合储备液。
1.3 细菌DNA游离碱基的制备 ［2，3］ 及测定 取分离、纯化的菌株适量，经溶解、沉淀蛋白等，抽提出DNA，按干品约0.5mg（湿品约50mg）加72%高氯酸1.0ml，完全溶解后，在沸水溶中水解40min，冷却后，用水稀释2倍测定。
1.4 标准的测定 取鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）各为1.00mg/ml标准混合储备液稀释成0.010mg/ml和0.10mg/ml标准应用液。取0.010mg/ml标准应用液0，1.00，5.00，10.0ml以及0.10mg/ml标准应用液5.00，10.0ml，加水至10.0ml，配成鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）各为0，1.00，5.00，10.0，50.0，100（μg/ml）标准系列，进样20ul测定。
2 结果分析及讨论
2.1 检测波长的选择 经实验:鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）最大吸收波长在254nm左右，本文选用254nm为测定波长。
2.2 流动相的选择 选用甲醇和0.02mol/L乙酸铵溶液作流动相，按表1梯度洗脱，可以完成细菌DNA碱基的完全分离。
2.3 分离效果 从100ug/ml混合碱基标准的色谱图（图1）可知，鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）在254nm测定，可完全分离。胞嘧啶（C）（tR=3.471）、鸟嘌呤（G）（tR=5.390）、胸腺嘧啶（T）（tR=6.072）、腺嘌呤（A）（tR=8.495）。图2为4号细菌的DNA碱基成分的分离图。从图2可以看出，胞嘧啶和腺嘌呤出峰稍有延后现象。
2.4 线性范围与最低检出浓度 胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A））在0～100μg/ml范围内，浓度C与峰面积（Area）呈直线相关关系。方法的线性范围、最低检出浓度见表1、表2。
表1 标准系列测定值 （浓度μg/ml-峰面积）（略）
2.5 方法的精密度和准确度 对样品中胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A））进行了6次测定，结果见表3、表4。
表3 方法的精密度（略）
测定值 测定次数 均值 RSD%胞嘧啶（C）2.14～2.24 7 2.18 1.625.4～26.2 6 25.8 1.277.2～78.0 6 77.5 0.36鸟嘌呤（G）2.14～2.40 7 2.26 3.425.0～25.7 6 25.4 1.177.0～77.8 6 77.4 0.37胸腺嘧啶（T）2.30～2.41 7 2.34 1.925.4～26.0 6 25.7 0.8377.0～77.8 6 77.4 0.39腺嘌呤（A）2.29～2.42 7 2.34 2.324.6～25.4 6 25.0 1.577.0～77.7 6 77.4 0.39
表4 方法的准确度（略）
2.6 方法的应用 我们于2004年3月9日对江油市疾病预防控制中心提供的已死亡的病猪和感染者（屠宰工）血液中分离出的1～4号细菌以及质控菌株（福氏志贺氏菌X变种）的细胞DNA水解液进行测定，测定结果以mmol/L计（胞嘧啶的分子量为111.1，鸟嘌呤的分子量为151.13，胸腺嘧啶的分子量为126.1，腺嘌呤的分子量为135.13），并计算其G+Cmol%=（G+C）/G+C+2A，见表5。
表5 细菌DNA游离碱基的测定（略）
根据1～4号细菌的DNA游离碱基的构成，计算G+C mol%值，与相关文献 ［1］ 进行比较，结合细菌的生化反应特性，对1～4号细菌初步鉴定为克雷伯氏菌属，与后来中国疾病预防控制中心的鉴定结果土生克雷伯氏菌相吻合。高效液相色谱法测定细胞DNA中的碱基成分，能对表型特性相似，临床生化反应相同，难以鉴别的细菌，尤其是对一个新菌种作出辅助鉴定。（本文图片见附页1）
参考文献
1 孟昭赫主编.食品卫生检验方法注解（微生物学部分）.北京:人民卫生出版社，1990，581-614.
2 许化溪，王胜军，黄锡金，等.高效液相色谱与荧光法测定细菌染色体碱基组成的比较.中华检验医学杂志，2000，23（4）:237-240.
3 吴新刚，熊深.医院感染肺炎克雷伯菌的染色体和质粒DNA指纹图分析.中华检验医学杂志，2003，26（6）:252-254.
作者单位:621000四川省绵阳市疾病预防控制中心
四川省江油市疾病预防控制中心