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1 材料与方法
1.1 动物模型及实验分组 称取体重为150～160g的雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠30只（中山大学动物实验中心提供），随机分成3组，每组10例;其中第1、2组为造模组，制作参考陈广平等 ［3］ 的抗Thy-1大鼠肾炎模型，大鼠尾静脉每周注射兔抗大鼠Thy-1抗血清（ATS）0.5ml/100g体重1次，连续4次;第3组为正常对照组。第1组，丹芍丸治疗组:造模开始后，每日灌服丹芍丸（0.4g/100g）体重1次;（丹芍丸的制剂方法、有效成分的测定及给大鼠的灌服剂量均参考动物实验学要求）;第2组，单纯模型组:造模开始后，每日普通饲养;第3组，正常对照组:实验过程中不造模，每日普通饲养。
1.2 药物 丹芍丸由丹皮、白芍、茯苓、泽泻、旱莲草、女贞子、蒲公英、蝉衣组成，由广东顺德桂洲医院制药厂研制供临床及实验使用，其生产工艺:丹皮、白芍、茯苓、女贞子、蝉衣五味粉碎成细粉，过筛，混均匀，其余三味加水煮2次，每次1h，合并煎液，过滤，滤液浓缩至适量，加炼蜜15～20g与上述细粉混合，水泛即得;其检验、鉴别方法均符合国家药典标准（中国药典1990年版附录55页）;含量测定:取本品约2g，精密称定，用水蒸汽蒸馏，收集馏出液约450ml，置500ml量瓶中，加水稀释至刻度，照分光光度法（中国药典1990年版一部附录51页），在274nm波长处测定吸收度，按丹皮酚（C 9 H 10 O 3 ）的吸收系数（E 1961cm ）为862计算，本品含丹皮酚（C 9 H 10 O 3 ）计算，不得少于0.15%。
1.3 主要试剂及仪器 LSAB免疫组化试剂盒（DAKO公司生产，包括:含兔血清的阻断液、生物素连接的兔抗鼠抗体、过氧化酶连接的链霉素卵白素）、蛋白酶K（Boehringer Mannheim公司）、兔抗鼠MIP-1α单抗（RD公司）、ATS制备参考陈广平等 ［3］ 的兔抗大鼠Thy-1抗血清制备方法，普通光学显微镜（Olympus）、全自动图像分析系统（KONTRON IBAS2.5德国）。
1.4 实验方法 各组于实验的第28天处死全部大鼠，取肾组织做电镜、光镜检查，通过免疫组化法检测肾组织MIP-1α的表达:取10%福尔马林固定的石蜡切片常规脱蜡水化，置于0.01M pH6.0枸橼酸钾缓冲液中，微波高火加热15min修复抗原，自然冷却至室温后0.01M pH7.4磷酸缓冲液（PBS）洗5min×2次;加0.3%过氧化氢甲醇溶液以阻断内源性过氧化物酶，室温20min，PBS洗5min×2次;加含正常兔血清的阻断液（1:20）以阻断非特异性结合，室温孵育20min;甩掉孵育液后加兔抗鼠MIP-1α单抗（1:100），4℃孵育过夜，以PBS为阴性对照;PBS洗5min×2次，加生物素连接的兔抗鼠抗体（1:400），室温孵育半小时，PBS洗5min×2次;加过氧化酶连接的链霉素卵白素（1:400），室温孵育半小时，PBS洗5min×2次;DAB（3，3-二氨基联苯胺）显色，水洗后苏木素复染，中性树脂封片镜检，每张切片取6个肾小球及6个间质视野，全自动图像分析系统计算每个肾小球横切面上MIP-1α阳性区域吸光度与肾小球横切面面积之比，每平方毫米间质MIP-1α阳性区域吸光度。
1.5 统计学方法 收集各实验数据在肾病实验室及动物实验中心完成。计数资料采用χ 2 检验;计量资料采用均数±标准差表示，两组均数比较用t检验，以上统计在计算机上采用SPSS for Windows10.0软件包进行。
2 结果
三组大鼠肾组织MIP-1α表达的比较，见表1。第3组（正常对照组）肾组织无MIP-1α表达，第1组（丹芍丸治疗组）及第2组（单纯模型组）肾组织均有MIP-1α表达，与正常对照组比较有明显差异（P<0.05），而丹芍丸治疗组肾组织MIP-1α表达水平明显低于单纯模型组，两者比较有明显差异（P<0.05），说明丹芍丸治疗可明显降低大鼠肾组织MIP-1α的表达，但达不到正常水平。
表1 三组大鼠肾组织MIP-1α表达的比较 （略）注:丹芍丸治疗组与单纯模型组比较， * P<0.05;丹芍丸治疗组、单纯模型组与正常对照组比较， △ P<0.05
3 讨论
近年来趋化因子在肾脏病变的作用日益受重视，其在肾脏表达的上调主要与肾小球及间质炎症损害有关 ［4］ ;MIP-1α是趋化因子家族的一个重要成员，由T细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞及系膜细胞、成纤维细胞等产生 ［5］ ，其功能为:趋化单核细胞及T细胞，对中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、B细胞等亦有趋化作用 ［6］ ;上调单核细胞整合素表达，致血管内皮细胞E-选择素表达升高而活化内皮细胞，促进单核细胞粘附于血管内皮进行迁移 ［7］ ;具有多种生物学功能如促进浆细胞和嗜碱性粒细胞释放组织胺、活化T细胞 ［8］ 、诱导巨噬细胞释放炎症介质 ［9］ 等;这些功能对肾小球硬化、肾小管间质损伤及间质纤维化有重大意义 ［10，11］ 。在多种肾小球肾炎包括MsPGN的研究中 ［12］ 证实了MsPGN肾小球及间质炎症浸润细胞、肾小球系膜区及小管上皮细胞有MIP-1α蛋白的表达，并反映肾脏的炎症状态 ［4］ ，且发现它促进巨噬细胞增殖，诱导巨噬细胞释放肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子及溶酶体酶、活性氧介质、一氧化氮等 ［9］ ，而这些炎症因子及炎症介质能促进MC过度增生并突入肾小球毛细血管管腔，导致管腔狭窄或闭塞，产生大量的细胞外基质，致使肾小球硬化，肾功能丧失;并可作用于其它炎症细胞，细胞因子又以自分泌、旁分泌的形式影响MC的生物活性，加重炎症的扩展和恶性循环，最终导致肾小球硬化、间质纤维化、肾功能衰竭。因此肾组织MIP-1α表达的上调对MC的迁移、增殖有重要意义，对MsPGN的发生、发展及预后起重要作用。MsPGN的西药治疗主要采用激素、免疫抑制剂、细胞毒性药物，其毒副作用较大，治疗效果不理想 ［1］ ，在中医辨证上多属湿热之邪蕴结，复加脾肾之气亏损，久则伤及肾气，造成脾不敛精，肾不固精，阴精耗损致肝肾阴虚，病机上面临正虚邪盛、本虚标实、虚实错杂的矛盾，治疗上扶正则留邪、祛邪则伤正，较为棘手;寻求好的治疗方药及手段较为迫切。以往研究发现MsPGN的中医证型以肝肾阴虚、湿热留恋型为多 ［13］ ，李俊彪教授通过近20年的中医肾病临床工作及科研总结出丹芍丸，在临床获得较好疗效，其中丹皮清热凉血、活血化瘀，白芍养阴敛阴、柔肝平肝，旱莲草、女贞子滋养肝肾之阴，茯苓、泽泻利水渗湿，蒲公英清热解毒、 利湿通淋，蝉衣疏风热、息风止痉等;该药具有养阴清虚热而不留湿，清热利湿而不伤阴的功效 ［2，13，14］ 。既往研究证实了丹芍丸可减少慢性肾炎尿中畸形红细胞的排泄量 ［2，14］ ，减少尿蛋白、保护肾功能 ［2］ ，提高患者红细胞免疫功能 ［13］ ，并降低患者TNF-α ［15］ 、IL-6 ［16］ 而抑制炎症反应;而MIP-1α和TNF-α、IL-6这两个炎症因子密切相关。本研究选用陈氏改良的大鼠抗Thy-1抗体肾炎模型进行实验，该模型病变持续时间可达28～35天，较符合临床所见到的人的系膜增生性肾炎，且该模型与人类阴虚湿热证型的病理改变比较类似 ［17］ ，实验结果初步显示丹芍丸能降低大鼠MsPGN模型肾组织MIP-1α的表达，但降低的程度达不到正常水平，提示丹芍丸可能是通过降低肾组织MIP-1α的表达而起效，但仍需在临床和实验中作进一步探讨。
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基金项目:该研究获得2001年度广东省中医药局基金资助（课题号:101131）
作者单位:510080广州中山大学附属第一医院中医科（ △ 肾内 科，△△ 肾病实验室）