豆状核变性患者之肝细胞培养及超微结构观察

    【摘要】 目的  建立肝豆状核变性的肝细胞原代培养模型，并采用超微制片技术获细胞超微结构，使之对该疾病的研究能达到细胞超微结构水平。 方法  对肝豆状核变性患者采用外科手术取肝组织，应用Ⅳ型离体胶原酶消化分离的方法获的肝组织细胞悬液。再用差速离心机将肝细胞和其他细胞分离提纯后对肝细胞原代培养7～10天。收集培养细胞，利用超微制片技术获肝细胞的超微结构。 结果  取肝豆状核变性患者肝细胞，通过台酚兰染色示即时存活率可达95%。肝细胞培养7天后细胞存活率可达90%，细胞纯度达90%，细胞收集量达5×10 5 个。用超薄切片技术制片，在透射电镜下观察可见肝豆状核变性患者肝细胞胞浆及溶酶体内有铜颗粒聚集。 结论  采用肝细胞培养模型可消除由于不同个体内环境的差异对细胞的影响，铜障碍的缺陷利用超微制片技术使细胞在超微结构水平得以表达，提高了实验精确度，为HLD病机制的研究及新药的开发提供了新的途径。
    
　　【关键词】  肝豆状核变性 原代培养 细胞分离 超薄制片 超微结构
     
　　Hepatic cell isolating，culturing technique and ultramicrotomy on HLD patients
     
　　Hu Wen，Chen Ke，Wu Hongyang，et al.
   
　　Department of Pathology，Anhui Provincial Hospital，Hefei230001.
   
　　【Abstract】 Objective To establish the hepatic cell primarily culture model on HLD patients and accquire the cell ultrastructure，then the disease can be studied under ultrastructural level.Methods The surgical hepatic tissue from HLD patients was digested and isolated to cell suspendion by exsomatize collagenase IV.The hepatic cells were purificated by gradient centrifugal machine，and followed by primarily culture7～10days.After collecting fhe culture cells，using ultramicrotomy，the ultrastructure of the hepatic cell was accquired.Results The instant viability of sur-gical hepatic cells from HLD patients was95%by trpan-blue staining.After culturing7days，the viability was90%，the cell purity was90%.The cells collecting numbers were5×10 5 .Using ultramicrotomy，we observed that the copper grain aggregated in hepatic cell plasm and lysosome of HLD patients by electron microscope.Conclusion Using hepatic cell culture model，it can eliminate the influence from individual difference.Using ultramicrotomy，the copper dysbolism in cells can be observed by electron microscope，the accurate rate can be improved.This methods give us a new pathway for studying the pathogenesis and new drug therapy of HLD.
   
　　【Key words】 HLD primarily culture cell isolation ultramicrotomy ultrastructure
      
　　肝豆状核变性（hepatolenticular degeneration，HLD）又称Wilson's病，是一种常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病 ［1］ ，由于铜离子在机体各组织内慢性沉积，临床上患者以肝脏损害及震颤，扭转痉挛等锥体外系症状为主要表现。其中肝脏与HLD发病密切相关，它同时又是最主要的受累靶器官，故建立HLD的肝细胞模型并在超微结构水平上来研究HLD发病机制及评价药物疗效具有重要意义。肝脏是一个结构、功能复杂的实质性器官，由多种细胞组成，主要是肝细胞 ［2］ 。本文将HLD患者肝组织中的肝细胞进行分离、培养并采用超微制片技术获得肝病变的肝细胞的超微结构，现将该方法介绍如下。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 标本 随机选取临床表现及铜代谢检查均符合诊断标准 ［3］ 的HLD患者，其中男5例，女3例，年龄10～35岁，平均（18.75±10.92）岁，每例采用外科手术留取肝组织1～2cm 3 。
   
　　1.2 仪器 3250型水套式恒温培养箱（美国Forma公司），YJ-1450DA型超净工作台（苏州净化设备厂），640XXSZ型超速离心机（美国Beckmen公司），TGL-16G台式高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），Jelson P1000可调式微量移液器（法国Jelson公司），6孔培养板（丹麦Nunclon公司），日本电子JEM-1230型透射电镜（日本），LKB公司NOVA型超薄切片机（瑞典）。
   
　　1.3 试剂 台酚兰（美国Sigma公司），胶原酶Ⅳ型（美国Sigma公司），RPMI-1640培养基（美国Life公司），其余化学试剂均为AR级。
   
　　1.4 肝组织悬液的制备 留取的肝细胞放入30ml细胞培养液内，3min内送上超净工作台，以D-Hanks液（无Ca 2+ 、Mg 2+ 含有0.01%EDTA，37%，pH7.4）反复冲洗3次，再以细胞培养液尽量冲净肝细胞残存的血细胞，见肝组织呈淡红色或淡黄色，既用外科手术刀将肝组织切成1mm 3 碎快，移入锥型瓶，加入0.02%胶原酶Ⅳ型溶液，在37℃水浴箱中震荡消化4h，每30min震荡一次。
     
　　在消化过程中见消化液变浑浊，可用吸管吸出少量消化液在镜下观察，如组织已分离成细胞团或单个细胞，即可终止消化，用培养液制备肝细胞悬液。
   
　　1.5 分离培养肝细胞 取混合肝细胞悬液用200目尼龙筛过滤，用PRMI-1640培养液反复离心洗涤3次，每次37℃，500r/min×3min，以清洗残存的胶原酶和纯化肝细胞，在显微镜下观察肝细胞形态及纯化状态，用0.4%台酚兰染色判断细胞活率;血细胞计数板行细胞计数，当细胞活率大于90%方可以PRMI-1640培养液（含20%AB型血清）将细胞悬液稀释至1×10 5 /ml后移入六孔培养板，置5%CO 2 ，37%的CO 2 培养箱培养，12h后首次更换培养液，以后24h更换培养液一次，持续培养7～10d。
   
　　1.6 HLD患者细胞的收集及超微制片技术 将培养板放在倒置显微镜下观察，可见培养细胞融合成片达到占据整个视野的80%左右，再放入0.25%的胰蛋白酶消化3～5min，同时用50μl加液器轻轻吹打细胞使之离开培养板混合在培养液中。将混有细胞的培养液移入锥形离心管内，以4℃离心4000r/min，10～15min，使细胞沉淀为团块，轻轻吸取上清液，然后再沿管壁缓慢加入预冷的2.5%戊二醛固定15～30min，再吸去固定液，加入缓冲液清洗2次10min后过夜。次日将细胞团块切成1mm 3 大小，后固定于1%锇酸30～60min，水洗10min后用梯度酒精脱水120min。环氧丙烷透明30min，然后在环氧树脂与环氧丙烷等量混合液中浸泡120min，再入纯环氧树脂120min，把细胞团取出后放入含有环氧树脂包埋液的包埋板中置60℃恒温箱中固化24～48h，将固化好的细胞先进行半薄切片，光镜定位后再行超薄切片，片厚以观察切片的干涉颜色，选浅黄色较好，厚薄应为70nm左右。最后将切片进行电子染色，一般常用醋酸铀饱和液染30min，水洗3次，用柠檬酸铅染15min。水洗后干燥电镜观察。

　　2 结果
    
　　2.1 患者肝细胞的活率及贴壁时间 患者肝细胞即时活率可达95%，培养后细胞活率可达95%，肝细胞纯度可达90%，5h肝细胞开始贴壁，24h有5%，36h活细胞可完全贴壁，约有5%～10%左右的受损伤细胞贴壁后会再次脱落。

　　2.2 HLD患者的肝细胞形态特征及鉴定 在细胞悬液中，肝细胞直径约20μm，原代培养过程中，肝细胞由球形变扁薄，体积增大，直径约22～30μm，核清晰，部分呈多边形，24～48h双核细胞增多。在电子显微镜下观察，肝细胞溶酶体和胞浆中均可见大量的铜颗粒。
    
　　3 讨论
    
　　目前对肝细胞的分离和培养，国内外报道很多，大多集中在动物的原代培养上 ［4］ 且大多采用原位肝灌注制备肝细胞悬液 ［5］ ，对肝细胞离体培养报道甚少，本实验采用胶原酶离体消化分离肝细胞，制备肝细胞悬液，不需要原位灌注或离体灌注，对较小的标本即可进行分离，培养，易于开展。同时，电镜下发现患者肝细胞的溶酶体和胞浆中有大量的铜颗粒聚集（见图1、图2），进一步在形态上证实了HLD的发病机制。
   
　　自1980年Chan等首次将离体培养皮肤成纤维细胞模型用于遗传缺陷的研究以来，此模型被广泛用于该病的研究，目前已进入较为成熟的阶段。HLD是由于铜代谢障碍而引起的铜中毒性疾病，肝脏为主要的受累靶器官，离体培养肝细胞进行研究应为最理想的细胞膜型。但由于培养条件复杂，另外与皮肤与纤维细胞相比取材困难，目前国内外尚未报道。本方法用离体培养肝细胞模型消除了由于不同个体内环境的差异对细胞的影响，铜代谢障碍的缺陷在细胞超微结构水平得以表达，提高了实验精确度，为HLD发病机制的研究及新药开发提供了新的途径。

　　（图1、2见封三）（略）
     
　　参考文献
    
　　1 Petrukhin K，Fischen GS，Pirastu M，et al.Mapping，conins and genetic characterization of region containing the Wilson disease gene.Nat Genat，1993，5:338.
   
　　2 孙宏训.肝细胞的超微结构.肝脏病理.第二版.南京:江苏科技出版社，1993，229-231.
   
　　3 杨任民.肝豆状核变性.合肥:安徽科技出版社，1995，167.
   
　　4 汪谦，夏惠生，姜汉英.大鼠肝细胞、Kupffer和Ito细胞的分离、培养.中华实验外科杂志，1994，18（5）:379.
   
　　5 王晓军，罗惠生，丁健，等.人肝细胞、窦状间皮细胞的分离培养.第三军医大学学报，1996，18（5）:379.
   

　　作者单位:230001安徽合肥安徽省立医院病理科电镜室
   
　　　　　　　　　　安徽中医学院神经病研究所