人脐静脉内皮细胞分离培养的改进及其鉴定

    【摘要】 目的  改进静脉内皮细胞原代培养的方法，提高体外培养血管内皮细胞的成功率。 方法  采用5号带柄一次性静脉输液针灌注消化液，分别用0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶消化脐静脉内膜，比较三种酶液消化的结果，并在倒置相差显微镜下观察其形态特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。 结果  0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶的最佳消化时间分别为15min，10min，12min。倒置相差显微镜下观察内皮细胞为单层生长，鹅卵石样镶嵌排列。免疫组织化学检测表明细胞内有Ⅷ因子相关抗原。 结论  胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液，且0.1%胶原酶消化12min获得的细胞数量多，成活率高。
      
　　【关键词】  人脐静脉 内皮细胞 细胞培养 分离 改进
     
　　Improvement of separation，culture and identification of human umbilical vein endothelial cells
     
　　Zhang Xiaoyan，Liang Chao，Zhao Lin，et al.
   
　　The Institute of Medical Sciences of Jiangxi Province，Jiangxi330006.
  
　　【Abstract】 Objective To investigate the primary culture method of ehdothelial cells from human umbilical vein and improve the rate of successful culture in vitro.Methods 0.125%，0.25%trpsin and0.1%collagenase were injected into the human umbilical vein by using disposable vein transfusion needle No.5，after which the endothe-lial cells were identified by morphology and immunohistochemistry under inverted microscope.Results The cultured cells had a cobble stone appearance with a strict monolayer growth and hadⅧrelated antigen.There are many en-dothelial cells after digested by0.125%，0.25%trpsin and0.1%collagenase for15minutes，10minutes，12minutes respectively.Conclusion The collagenase was the best choice to isolate ehdothelial cells from human umbilical vein.
     
　　【Key words】 human umbilical vein endothelial cells cell culture separation improvement
      
　　血管内皮细胞具有多种生理功能，能产生和分泌许多生物活性物质，在维持血管舒缩，抗凝血等方面起重要作用。体外血管内皮细胞的成功培养是研究内皮细胞功能及其在各种疾病发生发展中所起作用的基础。本文报告利用健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带，采用改进的灌流消化法 ［1］ 分离脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）成功传代培养并予鉴定，方法可靠，简便易行，有利于后续实验研究的进行。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 标本采集 在无菌条件下取正常妊娠足月分娩的新生儿脐带（长于20cm）后，去除脐带血管中的残余血液，放入含青、链霉素的磷酸盐缓冲液PBS中，6h内行脐静脉内皮细胞分离、培养。
   
　　1.2 试剂 RPMI1640培养基（美国GIBCO公司），新生小牛血清（杭州四季青生物公司），Ⅰ型胶原酶（美国GIBCO公司），胰蛋白酶（美国GIBCO公司），兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

　　1.3 仪器 Ⅱ级生物安全柜（苏净集团安泰公司），CO 2 培养箱（日本SANYO），倒置荧光显微镜（重庆光学仪器厂）。

　　1.4 试剂配制 RPMI1640完全培养液:20%新生小牛血清，80%RPMI1640，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。Ⅰ型胶原酶溶液:用不含Ca 2+ 、Mg 2+ 的Hanks液配制，0.22μm滤膜滤过除菌，保存于-20℃。
   
　　1.5 人脐静脉内皮细胞原代培养 无菌条件下取新生儿脐带，在Ⅱ级生物安全柜内剪去钳痕、血肿、凝血块阻塞部分，分成20cm一段，采用5号带柄一次性静脉输液针吸取36℃预热双抗PBS，插入脐静脉断端，同时结扎固定针体，反复将静脉内残血冲洗干净，再用血管钳夹闭脐带另一端，然后分别注入所配制0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶消化液，使管腔充盈，37℃，作用6、8、10、12、15、17min;松开一端血管钳，收集脐静脉内的消化液，然后注入含10%新生小牛血清的RPMI1640培养液再次冲洗管腔，以获得更多的内皮细胞;将消化液和冲洗液一并注入离心管，800r/min，离心5min，弃上清，加入RPMI1640培养液，吹打均匀，制成细胞悬液，按2×10 5 个细胞/瓶接种于25cm 2 一次性培养瓶中，置于37℃，5%CO 2 培养箱中培养。24h后更换培养液去除未贴壁细胞，然后每隔24h半定量换液一次至细胞生长融合。
   
　　1.6 人脐静脉内皮细胞传代培养 待细胞生长成单层细胞后，弃去培养瓶中的培养液，然后加入0.125%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液约2ml，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，用Hanks液洗一次，再加入RPMI1640培养液终止消化，用吸管轻轻吹打混匀，按1:2比例接种传代。
   
　　1.7 人脐静脉内皮细胞生长率的测定 具体方法参照“细胞培养” ［2］ ，选择第一代脐静脉内皮细胞，按每孔2×10 4 个细胞接种于24孔培养板内，37℃、5%CO 2 培养箱中培养，共培养8d。每天取3孔细胞，倒置显微镜下计数，取平均值，绘制生长曲线。
   
　　1.8 人脐静脉内皮细胞鉴定
   
　　1.8.1 形态学 利用倒置相差显微镜观察活体细胞的形态特点。
   
　　1.8.2 Ⅷ因子相关抗原检测 在24孔培养板内放置无菌盖玻片1cm×1cm，将内皮细胞悬液接种于盖玻片上，待内皮细胞长至汇合状态时，取出盖玻片，用PBS冲洗盖玻片，放入100%丙酮中固定15min，用PBS冲洗3次，每次2min，滴加3%的H 2 O 2 室温孵育8min，PBS冲洗3次，每次2min，滴加兔抗人Ⅷ因子相关抗原多抗工作液，放入湿盒内，4℃过夜，同时另一盖玻片上不加一抗作阴性对照。次日，用PBS冲洗3次，每次2min，滴加辣根酶标记的羊抗兔IgG，37℃孵育30min，用PBS冲洗3次，每次2min，用DAB底物混合工作液显色，显微镜下观察，待出现特异性染色后，终止显色，进行复染，脱水，透明，封片。

　　2 结果
    
　　2.1 培养细胞的形态学观察 倒置相差显微镜下观察，人脐静脉内皮细胞为单层生长，呈短梭状或鹅卵石样镶嵌排列。原代培养时，接种于一次性培养瓶后3h开始贴壁。最初细胞呈圆形，单个或聚集成团，后逐渐伸展呈长梭形，胞浆丰富，胞核清晰可见，为圆形或椭圆形，细胞间可见相互连接。5d后，细胞基本汇合。传代细胞较原代细胞生长旺盛，有时可见多核细胞，传至第8代时，细胞变形，呈纤维化，不能形成单层生长。
   
　　2.2 Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定 Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测，显微镜下观察细胞浆内可见棕色颗粒，核周密集，而对照细胞内未见着色。
   
　　2.3 细胞生长曲线 内皮细胞接种培养后，第1d细胞计数略有减少;第2d开始生长，但速度较慢;第3d生长速度加快，进入对数生长期;4～6d，细胞增殖仍然很旺盛，维持在对数生长期;7～8d，细胞数量达到饱和，产生接触抑制，进入停滞期。细胞倍增时间为72h。见图1。不同酶消化情况比较见表1。
     
　　图1 HUVEC生长曲线（略）
　　
　　表1 不同酶消化情况比较（略）
    
　　注:（-）内皮细胞数≤10/250倍视野;（+）内皮细胞数介于10～100/250倍视野之间;（++）内皮细胞数≥100/250倍视野
    
　　3 讨论
    
　　本实验选用脐带作为血管内皮细胞的来源，不仅取材方便，且脐静脉在很多方面具有与动脉相似的生物学特性。人脐静脉内皮细胞体外生长能力较差，原代培养不易成功。以往主要是采用机械分离法，将脐静脉剪开，用手术刀背等刮取内皮细胞或使用带有尼龙筛的分离管 ［3］，但这一方法很难掌握力度，用力太轻，取得的细胞数量很少;用力太重，易获得其他杂细胞如成纤维细胞等，而且此方法易损伤内皮细胞。本实验中，我们采用了5号带柄一次性静脉输液针固定灌流消化法，获得的细胞较纯，且能较好地保持其生物活性。实验研究的结果表明影响原代内皮细胞成功分离培养的因素主要有两点:（1）材料一定要新鲜。有研究表明，脐静脉内皮细胞离体后，随着时间的延长，细胞内一些物质的含量会发生变化。健康产妇新生儿脐带最迟应在12h内处理，处理前脐带可放在加有双抗的PBS中，4℃保存。时间超过12h后，细胞会出现水肿，变性，活力下降，甚至无法存活。有研究表明脐带离体3h内内皮细胞存活率为90%，离体24h后仅有50%存活 ［4］ 。（2）掌握消化酶的种类、浓度和消化时间甚为关键。大部分学者消化时选用胰蛋白酶或胶原酶。我们分别比较了0.125%、0.25%胰蛋白酶，0.1%胶原酶三种不同浓度酶液的消化能力，结果表明，在37℃培养条件下，0.125%胰蛋白酶消化15min;0.25%胰蛋白酶消化10min;0.1%胶原酶消化12min为最佳消化时间。在此条件下，分离出的血管内皮细胞数量多，杂细胞污染少，且细胞贴壁能力强。胰蛋白酶消化时对细胞的损伤较大;而胶原酶对细胞间质有较强的消化作用，能使上皮细胞与胶原组织成功分离，且不损伤内皮细胞，因此胶原酶被认为是最理想的血管内皮细胞分离酶。此外，血管内皮细胞在体内、体外的增殖缓慢，在内皮细胞培养过程中加入适量生长刺激因子，则可明显促进细胞生长 ［5］ 。
   
　　人体其它部位的血管内皮细胞来源困难，因此本脐静脉内皮原代细胞分离培养方法的改进，经济实用，简便易行，有利于获得所需的体外实验模型细胞，为进一步研究血管内皮细胞的生物学特性及其与各种疾病的关系提供帮助。
    
　　（本项目在江西省医学生物高技术重点实验室完成）
    
　　参考文献
    
　　1 鄂征.组织培养和分子细胞学技术.北京:北京出版社，2001，125-126.
   
　　2 司徒镇强，吴军正.细胞培养.西安:世界图书出版公司，2004，241-243.
   
　　3 Piebe M，Paulsen F，Jalnke T，et al.Mechanical brushcatheter abrasion method for the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.First in vitro results，2001，173（10）:955-958.
   
　　4 程满根.血管内皮细胞单克隆抗体研究.国外医学·生理、病理科学与临床分册，1989，10（3）:138-141.
   
　　5 Du XL，Sui GZ，Stocklauser FK，et al.Induction of apoptosis by high proinsulin and glucose in cultured human umbilical vein endothelial cells is mediated by reactive oxygen species.Diabetologia，1998，41:249-253. 

　　作者单位:330006江西南昌江西省医学科学研究所