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【摘要】 目的 本研究观察高脂饮食对阿霉素肾病（ADR）模型大鼠肾脏TGF-β 1 基因表达的影响，并探讨辛伐他汀及苯那普利对ADR大鼠肾脏TGF-β 1 基因表达的影响。 方法 根据大鼠TGF-β 1 cDNA的序列，设计TGF-β 1 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的引物，以RT-PCR法观察不同组大鼠肾脏TGF-β 1 mRNA在4，8，12周时的表达，并以GAPDH为内参照;标记（地高辛）TGF-β 1 探针，在不同组大鼠的肾组织冰冻切片上作原位杂交，检测12周时大鼠肾脏TGF-β 1 mRNA的表达情况。 结果 高脂饮食ADR大鼠4，8，12周时肾脏TGF-β 1 mRNA表达逐步上调，8，12周明显高于普通饲料肾病大鼠，12周时原位杂交结果表明高脂饮食肾病组肾脏TGF-β 1 mRNA增强明显，以小管间质为主，而普通饲料肾病组TGF-β 1 mRNA表达主要在小管间质，呈局灶性分布;辛伐他汀组和苯那普利组大鼠肾脏TGF-β 1 mRNA表达较高脂饮食肾病大鼠组明显降低;正常大鼠高脂饮食组TGF-β 1 mRNA表达在12周时高于正常对照组。 结论 高脂饮食ADR大鼠肾脏促纤维化因子TGF-β 1 mRNA随时间延长表达明显上调，表达以小管间质为主;辛伐他汀及苯那普利能明显降低肾脏TGF-β 1 mRNA的表达，辛伐他汀降低肾脏TGF-β 1 mRNA的作用机制可能与降低高脂血症相关的RAS活性有关，还可能与抑制MVA通路的间接作用有关;而苯那普利降低大鼠肾脏TGF-β 1 mRNA表达与其直接抑制AngⅡ介导作用有关。
【关键词】 高脂血症;纤维化;TGF-β 1 ;辛伐他汀;苯那普利
Study on renal expression of TGF-β1 mRNA in ADR-induced experimental nephrotic rats given high lipid diet
PENGWen，LIUYu-jun，SUN Zhong-lun.
Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM，Shanghai200062，China
【Abstracts】 Objective This study was to examine the changes of renal TGF-β 1 mRNA expression in ADR exper-imental nephropathy rats given high lipid diet and the effect of using simvastatin and benazepril.Methods Using RT-PCR to detect the expression of renal TGF-β 1 mRNA in different groups at4，8and12weekend，the GAPDH mR-NA expression used as control.Using in situ hybridization to examine TGF-β 1 gene expression in different groups at12weekend.Results TGF-β 1 mRNA expression of ADR nephrotic rats increased steadily after4weekend and its gene expression was higher than that with normal diet at8and12weekend.The results of using in situ hibrydization showed high level of TGF-β 1 mRNA positive signal at12weekend in ADR nephrotic rats given high lipid diet，the positive signals mainly located in tubulointerstitial zone disseminately while few found in glomerular，and focal gene positive signals distributed in tubulointerstitial was showed in normal dietary nephrotic rats.The expression of TGF-β 1 mRNA decreased in Simvastatin and Benazepril groups significantly.There was no different expression of TGF-β 1 mR-NA between normal rats given high lipid diet and normal diet during4and8weekend but slight higher gene expression came in high lipid dietary group at12weekend compared with normal control.Conclusion The expression of TGF-β 1 mRNA in ADR nephrotic rats given high lipid diet increased steadily as time went on，the positve signals of TGF-β 1 mRNA mainly located in tubulointerstitial zone.The treatment of simvastatinor benazepril were proved to be effec-tive in decreasing the high expression of TGF-β 1 mRNA in ADR nephrotic rats given high lipid diet.The possible ef-fect of simvastatin is due to reducing the activity of RAS induced by hyperlipidemia or through its negative effect on MVA pathway;while benazepril's inhibition on this gene expression might be mediated by inhibiting the production of angiotensinⅡ.
【Key words】 hyperlipidemia;fibrosis;TGF-β 1 ;simvastatin;benazepril
动物模型中，高脂饮食在一定的观察期后能形成类似人FSGS病变。肾病大鼠给予高脂饮食后，肾小球硬化明显加重，并加速进展至CRF ［1］ 。近年来，大量的研究显示多种细胞因子参与肾病进程，其中起主要作用的是TGF-β 1［2］ 。TGF-β 1 广泛分布于血小板，巨噬细胞及肾脏组织，能通过增加ECM蛋白的合成，抑制其降解及调节细胞-整合素受体促进ECM的积聚，并吸引单核细胞和刺激成纤维细胞转变成纤维细胞，促进肾脏硬化 ［3］ 。目前认为，TGF-β 1 在肾组织中持续过度表达是引起肾小球硬化的重要原因 ［4］ 。我们用RT-PCR和原位杂交观察高脂饮食ADR肾病大鼠肾脏的TGF-β 1 的基因表达及在肾小球，肾小管间质的分布，并分别观察辛伐他汀和苯那普利对高脂饮食肾病大鼠肾脏TGF-β 1 的基因表达的影响，及高脂饮食正常大鼠12周时TGF-β 1 基因表达。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 雄性SD大鼠60只（由上海医科大学动物房提供），体重（190±10）g，ADR制成肾病模型，将实验动物随机分为肾病+高脂饲料组（AH），肾病+高脂饲料+辛伐他汀组（AHS），肾病+高脂饲料+苯那普利组（AHB），高脂饲料组（HC），普通饲料+阿霉素组（AC）及正常对照组（C），每组10只。根据大鼠TGF-β 1 cDNA的序列，设计TGF-β 1 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的引物，以RT-PCR法观察不同组大鼠肾脏TGF-β 1 mRNA在4，8，12周时的表达，并以GAPDH为内参照在紫外光激发下，用乐 凯黑白胶片拍照，用T90型图像处理系统对胶片进行分析。采用固有RNA法进行RT-PCR的半定量分析。用GAPDH mRNA作为内参照，检测不同处理方法对大鼠肾脏TGF-β 1 mRNA水平的影响。用相同的逆转录产物进行PCR，使其控制在指数期，用GAPDH产物的光密度值校正TGF-β 1 产物的光密度值，然后用校正值进行统计分析。标记（地高辛）TGF-β 1 探针，在不同组大鼠的肾组织冰冻切片上作原位杂交，检测12周时大鼠肾脏TGF-β 1 mRNA的表达情况。
1.2 试剂 总RNA提取试剂盒购自Promega公司;TGF-β 1 原位杂交试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。
1.3 统计学分析 采用EPI5.0软件对数据进行统计分析。各指标均用ˉx±s表示，两组间比较采用t检验。 2 结果 见表1，图1。（略）
表1 各组大鼠肾脏RT-PCR检测TGF-β 1 产物mRNA的cDNA水平变化（略）
注:各组大鼠肾脏RT-PCR检测TGF-β 1 产物mRNA的cDNA水平4，8，12周与4周比较a:P>0.05，b:P<0.05;各组大鼠肾脏RT-PCR检测TGF-β 1 产物mRNA的cDNA水平8，12周与AH组比较:c:P<0.05与AC组相比均明显升高，半定量分析也表明AH组肾脏TGF-β 1 产物mRNA的cDNA由4w至8w上升明显，而由8w至12w升高幅度减缓;AHS组8w，12w时较AH组有明显差别，与AC组差异不显著;AHB组肾脏TGF-β 1 产物mRNA的cDNA8w，12w时较AHS组略低，无显著差异;但其8w，12w肾脏TGF-β 1 产物mRNA的cDNA水平略高于HC组。HC组肾脏TGF-β 1 产物mRNA的cDNA8w，12w时较C组相比无显著差异。
原位杂交结果显示:AH组大鼠在12w时可见肾小管细胞有蓝褐色阳性细胞，弥漫，肾小球染色略浅，表明TGF-β 1 mRNA在本组大鼠中信号已明显增强，且弥漫性分布;AC组大鼠在12w时可见肾小管间质细胞有蓝褐色阳性信号，局灶，肾小球染色浅，表明TGF-β 1 mRNA表达比高脂饮食肾病大鼠局限;AHS组大鼠12w时TGF-β 1 mRNA阳性细胞在小管中明显，分布散在，信号较弱;AHB大鼠在12w时TGF-β 1 mRNA阳性细胞在小管中弱，低于AHS组;HC组12w时TGF-β 1 mRNA阳性信号细胞在小管中弱，少量散在分布，肾小球无阳性信号;C组大鼠12w时肾小球及肾小管均未见阳性信号细胞。
3 讨论
在不同的大鼠肾脏病变模型中，人们观察到高脂血症在加重肾脏病变的同时，可伴随肾脏TGF-β 1 mRNA的表达增高，并发现其表达与肾脏的病变程度密切相关 ［5］ ，表明高脂血症至少部分通过TGF-β 1 引起肾脏损害。
现有的研究表明TGF-β 1 是一促纤维化生长因子，既有促进组织细胞增殖的特性，又有促进纤维化的作用，其能促进许多器官的纤维化。TGF-β 1 可明显增加培养的肾小球系膜细胞的数量 ［6］ ，还直接刺激基质分子如FN，胶原和蛋白聚糖的合成，抑制蛋白酶的分泌及诱导蛋白酶抑制剂的产生以阻止基质的降解 ［7］ 。TGF-β 1 可通过多种途径诱导组织纤维化，除促进肾小球硬化和肾小管上皮细胞凋亡外，还通过自分泌及旁分泌机制使间质成纤维细胞分化为纤维细胞，最终导致间质纤维化 ［8］ 。本研究采用两种方法观察高脂饮食ADR肾病大鼠肾脏的TGF-β 1 mRNA表达，用半定量RT-PCR法发现皮质肾组织TGF-β 1 mRNA在8，12w时均高于普通饲料肾病大鼠，与其肾脏形态学检查结果相一致。原位杂交也显示12w时高脂饮食ADR肾病组肾脏TGF-β 1 mRNA在肾小球及小管间质均呈阳性信号，呈弥漫分布，小管间质信号强，而普通饲料肾病组肾小球内阳性信号弱，小管间质仅呈局灶性变化，表明高脂饮食明显增强肾病大鼠肾脏TGF-β 1 mRNA的表达，分布以小管间质为主。而肾脏TGF-β 1 mRNA的高表达可明显加重肾脏的纤维化病变，因此认为高脂血症可能通过TGF-β 1 的作用促进肾病的进程。
实验观察到辛伐他汀对高脂饮食肾病大鼠肾脏TGF-β 1 mRNA表达的影响表现在治疗组大鼠肾脏肾小球及小管间质细胞阳性信号均较未治疗组明显减弱，且小管中阳性细胞呈局灶性分布，表明辛伐他汀在控制高脂血症的同时，不仅减轻肾小球和小管病变，还明显降低肾脏TGF-β 1 mRNA的表达强度，从而延缓肾脏的纤维化。但辛伐他汀如何降低TGF-β 1 mRNA在肾脏表达的确切机制不甚明了。有研究表明高脂血症时可出现RAS活性增高 ［9］ ，因此，我们认为辛伐他汀降低肾病大鼠肾脏TGF-β 1 的基因表达可能与其降低高脂血症而间接地抑制肾素-血管紧张素-TGF-β 1 轴的作用有关。
ACEI被证明能显著减轻或延缓肾脏的纤维化，作用机制与降低肾小球内压，抑制系膜细胞的扩张及抑制AngⅡ引起的TGF-β 1 高表达有关。本研究用苯那普利治疗高脂饮食ADR肾病大鼠，观察到肾脏TGF-β 1 mRNA的表达明显减弱，肾小球内阳性信号微弱，小管间质细胞中仅见少量的阳性信号，较辛伐他汀组大鼠的肾脏TGF-β 1 mRNA的表达低，表明抑制AngⅡ可明显降低肾病大鼠肾脏的TGF-β 1 mRNA的表达。AngⅡ可刺激肾间质细胞增殖及增加ECM的积聚，引起小管间质损害 ［10］ 。另外，通过内分泌，旁分泌及自分泌增加的TGF-β 1 还引起小管间质ECM的积聚和纤维化。因此，在高脂饮食ADR肾病大鼠模型中，用苯那普利治疗可减轻肾小球及小管间质病变，并下调肾脏TGF-β 1 mRNA的表达，进一步支持在慢性肾病过程中，抑制肾素-血管紧张素-TGF-β 1 对保护肾功能，延缓肾脏的硬化有重要意义。
单纯高脂饮食可引起大鼠肾脏FSGS的变化，本研究中单纯高脂饮食仅观察12w是为区别肾病模型组与正常型的差异。RT-PCR法12w时肾脏TGF-β 1 mRNA表达较正常增高，原位杂交中肾小球无阳性信号，肾小管仅见少量散在的阳性信号。结果表明高脂血症正常大鼠12w时，尽管肾脏损伤轻微，但已有肾脏TGF-β 1 基因表达的增高，也就解释肾脏疾病一旦发生，如不干预，则往往进行性发展的原因。
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作者单位:200062上海，上海中医药大学附属普陀医院肾内科
（编辑:文 静）