牛磺酸对Fas系统介导烧伤后早期心肌细胞凋亡的影响

    【摘要】  目的  观察牛磺酸对烧伤后心肌细胞凋亡和Fas系统的影响及初步机制。方法  选健康Wistar大鼠，随机分成对照组(Sham)、烧伤组(造成40%TBSA Ⅲ度烧伤)和烧伤加牛磺酸组(烫伤后即刻腹腔注射牛磺酸200mg/kg)。用原位末端标记(TUNEL)法检测凋亡细胞，RT-PCR检测Fas mRNA表达，免疫组化检测Fas/FasL和Caspase-8/3蛋白表达和荧光分析Caspase-3活性。结果  烧伤组大鼠伤后6h、12h和24h心肌细胞凋亡指数分别为7.31±2.31、21.52±2.57和18.67±2.48，较对照组(0.92±0.34)有显著性升高，Fas蛋白阳性表达指数分别为13.51±1.56、21.02±2.34和14.55±1.89，也显著性高于对照组(2.46±0.75)；Caspase-3活性分别为1.38±0.16、2.18±0.18和1.96±0.71，较对照组(0.35±0.06)差异有显著性。牛磺酸保护组在伤后6h、12h和24h心肌细胞凋亡指数、Fas蛋白表达和Caspase-3活性较烧伤组均有不同程度降低(P＜0.05)。烧伤组心肌细胞凋亡指数与Fas表达之间有良好的相关性(r=0.86,P＜0.05)。结论  牛磺酸对Fas系统介导烧伤后大鼠心肌细胞凋亡有较好的抑制作用。

    【关键词】  牛磺酸；Fas系统；细胞凋亡；心肌；烧伤
 
　　Effects of taurine on Fas antigen involvement in apoptosis of cardiomyocytes in early postburn stage

　　WAN Fu-sheng,Gong Wen-hua,ZHAO Xiao-man,et al.

　　Department of Biochemistry and Molecular Biology of Jiangxi Medical College,Nanchang 330006,China

　　【Abstract】  Objective  To investigate the effects of taurine on the apoptosis and expression change of Fas antigen in cardiomyocytes during the early postburn stage.Methods  Healthy adult Wister rats were randomly divided into the control group(without burned),the burned group(subjected to a 40% TBSA Ⅲ degree injury)and taurine treatment group(treated by intrapleural injuction taurine 200mg/kg).Terminal deoxynucleotidy transferase-mediated dUTP fluoescein nick end labeling(TUNEL),RT-PCR and S-P immunohistochemical staining were used respectively to determine the apoptosis and genes expression of Fas/FasL and caspase-8/3,and caspase-3 activity was detected by fluorospectrophotometry.Results  Cardiomyocytes apoptosis indexs of the burned groups at 6,12 and 24 postburn hours(PBHs)are 7.31±2.1,21.52±2.57 and 18.67±2.48 respectively,positive expression indexs of Fas protein are 13.51±1.56,21.02±2.34 and 14.55±1.89 respectively,caspase-3 activity are 1.38±0.16,2.18±0.18 and 1.96±0.71 respectively,compared with the control,there are all significant increase.There are good correlation(r=0.86,P＜0.05)between cardiomyocytes apoptosis indexs and Fas gene expression of the burned groups.Compared with the burned group,cardiomyocytes apoptosis indexs,Fas gene expression and caspase-3 activity of taurine treatment group were all lowered significantly at 6,12 and 24 postburn hours(PBHs).Conclusion  Fas antigen is involved in the cardiomyocyte apoptosis during the early postburn stage,and taurine exerts a good antagonist action on both Fas gene expression and apoptosis in the cardiomyocytes.

　　【Key words】  taurine；fas；apoptosis；cardiomyocyte；burn

    牛磺酸(Taurine,Tau)是心肌中含量最丰富的游离氨基酸，具有抗氧化，调节细胞渗透压、抑制细胞钙超载等多种生物学功能［1，2］，是一种良好的内源性细胞保护剂。笔者曾发现牛磺酸对再灌注损伤心肌细胞凋亡有较好的拮抗作用［2］，其机制可能与降低Fas死亡受体通路中相关蛋白酶水平及其活性有关［3］。随着细胞凋亡现象在多种心血管疾病中被证实，Fas系统是否参与介导烧伤后心肌细胞凋亡成为目前关注的热点。研究烧伤后不同时间心肌中Fas系统的表达变化与心肌细胞凋亡的关系，对阐明严重烧伤后心功能障碍甚至“休克心”发生的机制有重要意义［4，5］，对严重烧伤后多脏器损害的防治也具有重要指导作用。牛磺酸对烧伤后心肌细胞凋亡的影响如何，尤其它是否调控Fas等凋亡相关基因的表达，目前尚未见报道。本研究旨在观测牛磺酸对Fas系统参与严重烧伤后大鼠心肌细胞凋亡作用的影响及其初步机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  烧伤模型制作［6］  选成年健康Wistar大鼠(由江西医学院实验动物中心提供)90只，雌雄各半，体重(243±25)g，随机分成对照组(Sham)，烧伤组(B)和烧伤加牛磺酸组(B+Tau)。(1)烧伤组：腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，脱毛，24h后于92℃水浴18s，造成43% TBSA Ⅲ度烧伤(经病理切片证实)，按每公斤体重1%烧伤面积4ml等渗盐水腹腔注射，即将总量一半分为二等份，分别于伤后即刻和伤后4h注射，另一半分成4等份，分别于伤后8h,12h,16h及24h注射，分笼喂养大鼠，自由进食，饮水。并于伤后3h,6h,12h及24h处死动物，取心肌作有关分析。(2)烧伤加牛磺酸组(B+Tau)：在伤后即刻腹腔注射牛磺酸(200mg/kg)，余操作同烧伤组。(3)对照组(Sham):37℃水浴18s，不补液，1h后处死动物，余操作同烧伤组。

　　1.2  凋亡细胞的原位末端标记(TUNEL)及半定量分析  心肌组织常规石蜡包埋、切片。采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞核中DNA3′末端(试剂购自美国Interge公司)。结果判断：光镜下正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈深浅不一的棕色，即阳性细胞。每张切片选择5个视野，每个阳性视野计算200个细胞中阳性细胞数，以平均计算阳性细胞所占的百分比作为细胞凋亡指数(Apoptosis index，AI)。
　
　　1.3  Fas/FasL和Caspase-8/3蛋白表达及半定量分析  取上述心肌石蜡标本相应部位的连续切片5张，按S-P法进行免疫组化及HRP-AEC染色(北京中山生物技术公司)，第一抗体均为免抗鼠的Fas/FasL、Caspase-8及Caspase-3蛋白的多克隆抗体(santa Cruz公司)。每张切片于阳性区选择5个无重叠视野，每视野计数200个心肌细胞中阳性细胞数，以计算阳性细胞所占的百分比作为待测蛋白阳性表达指数(Positive expression index,PEI)。

　　1.4  Fas基因mRNA表达的检测及半定量分析  采用RT-PCR检测心肌中Fas及actin(作为内对照)的mRNA表达变化(试剂购自Promega公司)，扩增Fas的引物序列为上游引物：5′CCAGGGACTGATAGCATCTTTGAGG 3′，下游引物为5′TGTGAAAGTCCTGAACCCTAAGG 3′；C-actin上游引物为：5′TCATGAAGTGTGACATCG 3′，下游引物为5′AAACTGCACGTGTGTAAAC 3′，Fas扩增片段的长度为436bp,C-actin扩增长度为289bp。扩增步骤主要为：(1)一步法提取总RNA，要求总RNA浓度A260/A280为1.7～2.0；(2)单管行RT-PCR反应；将mRNA逆转录成cDNA及cDNA扩增过程在同一管内进行(具体操作按药盒说明书进行)。PCR反应条件为95℃ 2min，第1个循环，94℃ 30s,50℃ 30s，68℃ 60s重复35个循环，然后68℃延伸8min。(3)凝胶电泳与拍照：取10μl PCR反应产物于1.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)中电泳，紫外灯下观察、拍照。经密度扫描仪扫描分析结果，以Fas/actin积分比值反映心肌细胞Fas基因的mRNA表达指标。

　　1.5  心肌Caspase-3活性测定  取心肌0.3g，用冷生理盐水洗2次，剪碎，在100目和200目尼龙网上，用眼科镊子夹持，以冷PBS液冲洗，收集细胞置10ml离心管中，2000g离心5min，弃上清。用PBS(pH 7.4)洗沉淀2次，加细胞裂解液0.5ml，充分振荡后，室温下作用30min，15000g离心15min，取上清100μl加HEPES缓冲液1.0ml，再加AC-DEVD-AMC 10μg(1μg/μl)，37℃水浴60min，于激发波长385nm，发射波长465nm，测其荧光强度变化，其活性单位用DEVD-AMC nmol/(h·mg)蛋白表示。

　　1.6  统计学处理  所有实验数据均以x±s表示，采用SPSS 11.0软件处理分析，两组间比较采用Student's t检验，多组间比较采用方差分析。

　　2  结果

　　2.1  烧伤后心肌细胞凋亡数目变化  与假烫伤组(Sham)比较，烧伤组大鼠在伤后6～24h的不同时相点的心肌细胞凋亡指数均有显著性增加(P＜0.01)，在伤后12h，心肌细胞凋亡指数达峰值；烧伤加牛磺酸组心肌细胞凋亡指数显著性地低于烧伤组(P＜0.05)，表明牛磺酸对烧伤后心肌细胞凋亡有较好的拮抗作用(表1)。

　　表1  心肌细胞凋亡指数、Fas mRNA表达及Caspase-3活性  (略)

　　2.2  心肌组织Fas基因mRNA表达  心肌组织Fas基因mRNA经RT-PCR和电泳检测，经密度扫描仪测得Fas条带(436bp)与C-actin条带(389bp)峰面积积分，以Fas/actin比值表示Fas基因mRNA表达水平，结果显示，烧伤后3h心肌Fas基因mRNA表达即呈显著性升高，于伤后12h达峰值，伤后24h Fas基因mRNA表达仍显著性高于假烫伤组。与烧伤组比较，在烧伤后3h,6h,12h及24h，烧伤加牛磺酸组心肌Fas mRNA的表达均有显著性下降(P＜0.05)，表明牛磺酸对烧伤后心肌Fas基因mRNA表达有一定的抑制作用。

　　2.3  心肌组织Fas/FasL、Caspase-8及Caspase-3蛋白表达的变化  烧伤组大鼠心肌Fas蛋白表达在伤后3h即显著性高于对照组(P＜0.05)，于伤后12h达峰值，伤后24h仍显著高于对照组；FasL蛋白仅在伤后12h较对照组差异有显著性，Caspase-8蛋白在伤后3h也呈显著性增高，伤后24h仍高于对照组：Caspase-3蛋白表达在伤后6h开始呈显著性升高(见表2)，伤后24h仍高于对照组。与烧伤组比较，烧伤加牛磺酸组心肌细胞中Fas Caspase-8及Caspase-3蛋白表达在伤后6h、12h及24h均呈显著性降低(P＜0.05)。

　　表2  心肌组织Fas/FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白表达水平  ［略］

　　2.4  心肌组织Caspase-3活性变化  烧伤组大鼠心肌Caspase-3活性在伤后3h即显著高于对照组(见表1)，伤后12h达峰值，伤后24h仍然高于对照组；烧伤加牛磺酸组心肌细胞中Caspase-3活性在伤后6h、12h及24h较烧伤组均呈显著性降低(P＜0.05)。

　　2.5  心肌细胞凋亡与Fas系统表达的相关性  通过分析Fas蛋白表达指数(PEI)与心肌细胞凋亡指数(AI)间的关系，结果发现二者间有良好的相关性(r=0.86,P＜0.05)。并发现Fas蛋白表达与Caspase-3活性间也存在相关性(r=0.83,P＜0.05)。

　　3  讨论

　　最近研究表明［7］，细胞凋亡也参与了烧伤后心肌损害，其机制主要与线粒体结构与功能损伤、氧自由基及钙平衡失调有关。然而，细胞凋亡在烧伤后心脏功能障碍中的病理生理意义目前尚未完全被阐明。不难设想，对心肌细胞凋亡及时防治，不仅有利于心肌细胞存活和心功能改善，也有利于严重烧伤后“休克心”的防治。目前，许多证据表明Fas系统参与了心力衰竭、病毒性心肌炎、心肌缺血及再灌注损伤的心肌细胞凋亡［8，9］，但它是否介导严重烧伤早期心肌细胞凋亡尚未见报道。本研究结果显示，烧伤组在烧伤后6h心肌细胞凋亡开始呈显著性增多，心肌Fas mRNA和Fas蛋白表达在烧伤后3h即呈显著性增高，伤后24h仍显著高于对照组，Caspase-8蛋白和Caspase-3活性在伤后3h也均显著高于对照组；烧伤加牛磺酸组心肌细胞凋亡指数与烧伤组比较有显著性降低，且Fas mRNA和Caspase-8蛋白及Caspase-3活性均显著低于烧伤组。相关性分析表明，烧伤后心肌细胞凋亡与Fas表达之间有良好的相关性，提示Fas系统参与了烧伤后心肌细胞凋亡，牛磺酸对烧伤后心肌细胞凋亡拮抗作用的机制可能与抑制Fas表达有关。导致烧伤后心肌细胞凋亡因素很多，其中心肌缺血(氧)及大量炎性细胞因子(如TNFα)分泌是最重要因素之一。一方面心肌缺血(氧)可诱导凋亡活化因子Mtd基因表达，促进细胞凋亡；另一方面缺血(氧)可诱导心肌细胞表面Fas表达增加，进而与FasL结合触发凋亡的发生。

　　目前认为，介导细胞凋亡的途径主要有死亡受体通路、线粒体通路和内质网通路。其中以Fas死亡受体通路较为清晰［10，11］，它是由死亡配体死亡受体结合激活半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)而导致细胞凋亡，其主要过程包括死亡受体分子的活化、凋亡酶复合体的形成，即Fas-FasL-FADD-Caspase-8酶原串联构成的复合物及效应Caspase的活化。并认为Caspase是诸多调控通路的关键，三条凋亡通路最后都有Caspase的激活，而Caspase-3又处于Caspase级联反应的中心地位。Fas(Apo-1,CD95)是由Fas基因表达的一种分布于多种细胞表面的膜受体蛋白分子，也是一种凋亡相关抗原，其配体(FasL)则用FasL基因表达的大分子蛋白［8］。研究表明［12］许多病理因素如缺血、缺氧及病毒感染等均可诱导Fas和FasL的表达，当FasL与Fas结合后，可诱导细胞凋亡。本实验结果表明，心肌细胞凋亡是引起烧伤后心肌功能障碍的重要原因之一，Fas系统参与介导了烧伤后心肌细胞凋亡。通过抑制Fas系统信号通路中的某一环节或干预细胞凋亡，可望成为抑制烧伤后心肌细胞凋亡的重要手段。因此，牛磺酸对烧伤大鼠心肌Fas系统信号传递的拮抗作用及其机制，值得深入研究。

　　【参考文献】

　　1  万福生，刘波，赵小曼，等.牛磺酸对大鼠在体缺血再灌注心肌线粒体呼吸酶系的影响.基础医学与临床，2000，20(4)：333-335.

　　2  万福生，王青松，吴绮明，等.牛磺酸对心肌缺血损伤细胞凋亡与Fas/FasL基因表变化的影响.中国药物与临床，2004，4(1)：17-19.

　　3  伍伟锋，刘唐威，黄林新.Fas/FasL与心肌细胞凋亡.医学综述，2001，7(2)：73-74.

　　4  黄跃生.烧伤后早期心肌损害的分子机制及防治研究进展.中华烧伤杂志，2004，10(5)：257-259.

　　5  李华，万福生，杨薇，等.牛磺酸对心肌细胞凋亡的保护及其机制.南昌大学学报(理科版)，2004，28(2)：170-173.

　　6  黄跃生，李志清，吴庆云，等.缺血缺氧在大鼠烧伤后“休克心”中的作用及其机制研究.中华创伤杂志，2002，18(4)：205-209.

　　7  张家平，黄跃生，周新.严重烧伤大鼠心肌细胞凋亡与心功能损害的关系.中华烧伤杂志，2002，18(5)：272-274.

　　8  Timmer T,De Vries EG,De Jony S.Fas receptor-mediated apoptosis:a clinical application.J Pathol,2002,196(2):125-134.

　　9  Harald.The Fas signaling pathway:more than a paradigm.Science,2002,296(31):1635-1636.

　　10  Shigekazu N.Apoptosis by death factor.Cell,1997,88:357.

　　11  李晓玲，郑德先.死亡受体的信号传导途径及其调节机制.国外医学·分子生物学分册，2002，24(4)：225-228.

　　12  Chen YJ,Zhang X,Bu XY,et al.The Expression of Fas and Fas ligand in human gliomas.J Fourth Mil Med Univ,2000,21:80-82.

　　基金项目：国家自然基金资助项目(No.30060029)

　　作者单位：1 330006 江西南昌，江西医学院生化与分子生物学教研室

　　　　　　　2 330006 江西南昌，江西医学院附属第一医院烧伤中心

　　(编辑：秋  实)