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【摘要】 目的 观察吡咯烷二硫基甲酸盐（PDTC）对心肌肥大发生发展的影响并探讨其机制。方法 以缩窄小鼠主动脉弓(TAC)诱导的心肌肥大为模型，观察PDTC对心肌肥大发生发展的影响，并采用EMSA检测心肌组织中NF-κB结合活性，应用Western blot方法分析心肌组织中phospho-GSK3β的表达水平。结果 (1)缩窄小鼠主动脉弓2周后，心脏重量/体重比值与假手术组相比增高48.7% (P＜0.01)，而且肥大心肌组织中NF-κB结合活性和phospho-GSK3β(Ser9)蛋白表达明显高于假手术组(P＜0.01)。(2)PDTC可明显减轻TAC诱导的心肌肥大，与TAC模型组相比可以使小鼠心脏重量/体重比值下降16.4%(P＜0.05)。PDTC可抑制心肌组织中NF-κB活性，与TAC模型组相比降低了34.3%(P＜0.01)，同时亦可抑制心肌组织中GSK3β(Ser9)磷酸化水平，p-GSK3β(Ser9)/ GSK3β比TAC模型组降低了22.1%(P＜0.05)。结论 PDTC可以通过抑制NF-κB结合活性和GSK3β（Ser9）磷酸化水平延缓心肌肥大的发生发展。
【关键词】 心肌肥大；吡咯烷二硫基甲酸盐；核因子κB; 糖原合成激酶-3β
The preventive effect and mechanism of PDTC on the development of mice cardiac hypertrophy induced by pressure overload
LI Yue-hua,LI Jing,QUE Ling-Li.
Department of Pathophysiology,Nanjing Medical University,Najing 210029,China
【Abstract】 Objective To investigate the role and mechanism of PDTC on the development of cardiac hypertrophy in vivo.Methods PVB/N mice were employed and cardiac hypertrophy was induced by transverse aortic constriction for 2 weeks.Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was used to determine NFkB binding activity with nuclear proteins extracted from heart tissues; Western blots were performed to examine the phosphorylation of GSK-3β. In a separate experiment, PDTC was administered into mice subjected to transverse aortic constriction for 2 weeks.Results (1)Transverse aortic constriction(TAC) significantly increased the ratio of HW/BW. Two weeks after TAC, the ratio of HW/BW was significantly increased by 48.7%(P＜0.01), compared to age-matched sham control. NFkB binding activity and the level of phospho- GSK-3β(Ser9) were significantly increased at 2 weeks following TAC compared to age-matched sham control (P＜0.01).(2)Administration of PDTC into TAC mice for 2 weeks, significantly reduced the ratio of HW/BW by 16.4%(P＜0.05), compared to non-treated TAC mice. NFkB binding activity was significantly reduced by 34.3% (P＜0.01) in the hearts administered with PDTC for 2 weeks, compared to non-treated TAC group. In addition,administration of PDTC also decreased the level of phospho- GSK-3β(Ser9)/ GSK-3β by 22.1%(P＜0.05) compared to non-treated TAC group.Conclusion PDTC inhibit the NFkB binding activity and the level of phospho- GSK-3β(Ser9) in hypertrophic heart tissues and thereby attenuates the development of cardiac hypertrophy.
【Key words】 cardiac hypertrophy;pyrrolidine dithiocarbamate;NF-κB;GSK-3β
心肌肥大是心脏对生物机械牵张和神经体液刺激的一种主要反应。虽然早期心肌肥大是心脏维持有效心输出量的一种代偿性机制，但持久的心肌肥大会导致心脏进入失代偿阶段，继而发生不可逆转的心肌肥大和扩张，心肌收缩力下降，导致心力衰竭［1，2］。调控心肌细胞肥大的详细分子机制及关键的信号转导通路迄今尚未阐明。最近的研究提示核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号通路可能在心肌肥大的发生发展中起着重要作用［2，3］。吡咯烷二硫基甲酸盐（pyrrolidine dithiocarbamate ，PDTC）是NF-κB抑制剂，通过其抗氧化作用可抑制肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）诱导的反应性氧自由基的产生和NF-κB活性［4］。Dechend等也报道抗氧化剂可通过抑制NF-κB活性而解除AngⅡ所诱导的心肌细胞肥大性反应［5］。然而，Hayakawa等报道PDTC抑制NF-κB活性与抗氧化功能无关［6］。为此，本研究以压力负荷增加诱导的小鼠心肌肥大为模型，进一步探讨PDTC抑制NF-κB活性的机制，并观察PDTC对心肌肥大发生发展的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 药品与试剂：水合氯醛、PDTC(Sigma 公司产品)；NF-κB寡核甘酸、T4 Polynucleotide kinase、Gel Shift Banding 5xBuffer(Promega公司产品)；Pierce BCA蛋白分析试剂(Pierce化学公司产品)；［γ-32p］ATP(3000Ci/mmol)(Amersham公司产品)；p-GSK3β(Ser9)、 anti-Rabbit IgG HRP-Linked抗体(Cell Signaling公司产品)；GSK3β(H-76)(Santa Cruz Biotechnology公司产品)；ECL化学发光试剂盒(Amersham,Piscataway,NJ)；Kaleidoscope Prestained Standards蛋白质Marker(BIO-RAD公司产品)；SDS、丙烯酰胺、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)(Sigma公司产品)。实验动物：雄性PVB/N小鼠，美国东田纳西州大学实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 小鼠心肌肥大模型的建立 PVB/N小鼠周龄达6～7周时，经水合氯醛麻醉后，通过气管插管与啮齿动物呼吸机连接，进行人工通气。于胸部左侧第2～3肋间打开胸腔，分离主动脉弓并在其下穿一丝线，按统一标准使主动脉缩窄(Transverse aortic constriction,TAC),关闭胸腔。假手术组除了不进行TAC外，其余手术程序完全与模型组相同。
1.2.2 实验分组及给药 实验分为3组：(1)假手术组：假手术组除了不进行主动脉缩窄外，其余手术程序完全与模型组相同；(2)TAC模型组：缩窄主动脉弓二周；(3)PDTC处理组：小鼠于TAC前1h开始腹腔注射PDTC，剂量120mg·kg-1·d-1,持续2周。
1.2.3 样本的收集与检测 (1)心脏重量/体重比值:TAC 2周后，用水合氯醛麻醉小鼠后，取出心脏，统一标准修剪心脏、称重，计算心脏重量/体重比值，作为评估心肌肥大的指标。取左心室，-70℃保存待用；(2)胞浆、胞核蛋白的提取：左心室肌组织中加入Buffer A充分匀浆，在冰上放置15～30min，再加入适量的10%NP-40,混匀1min，4℃、10000r/min离心3min，上清即为胞浆蛋白。沉淀用Buffer C悬浮混匀，冰上放置1～2h，不时振动，再在4℃、14，000转/min离心10min，上清即为核提取物。采用Bradford方法，以BSA作标准测定胞浆和胞核蛋白浓度。胞浆和胞核蛋白提取物于-80℃保存备用；(3)NF-κB活性的检测:采用凝胶迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）方法。本实验中NF-κB同序寡核苷酸探针如下：3′-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5′;5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′,采用T4寡核苷酸激酶法以γ-32P-ATP（3000Ci/mmol）标记探针。核蛋白-DNA探针结合反应体系为：等量核蛋白提取物（30μg）,35 fmols［γ-32p］标记的双链NF-κB寡核苷酸,反应总体积为15μl。室温静置20min后加入加样缓冲液，经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。干胶后，-80℃放射自显影，图像采用Bio-Rad公司的phosphor-图像分析系统进行定量分析。(4)Western blot分析：经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离待测蛋白，并将其转移至硝纤膜上，用封闭缓冲液(5%脱脂奶粉，0.05%Tween-20 TBS) 封闭1h，然后与相应的特异性抗体孵育，4℃过夜。次日用封闭缓冲液漂洗3次，再与辣根过氧化物酶标记的相应二抗于室温孵育1h后，用0.05%Tween-20 TBS 漂洗3次。按0.125ml/cm2膜加上化学发光试剂，静置1～2min后，压X光片作为显影记录。采用phosphor-图像分析系统，进行定量辉度扫描分析。
1.2.4 统计学处理 本实验中所有数据均采用x±s表示，经方差齐性检验后，组间分析采用t检验。
2 结果
2.1 PDTC降低TAC小鼠心脏重量/体重比值 小鼠TAC 2周后，心脏重量/体重比值明显增加，与假手术对照组相比增加了48.7%［6.78±1.14(mg/g) VS. 4.56±0.34(mg/g),n=10,P＜0.01］。PDTC处理组与TAC模型组相比可以使小鼠心脏重量/体重比值下降16.4%［5.67±0.49 (mg/g) VS. 6.78±1.14 (mg/g),n=10,P＜0.05］。
2.2 PDTC降低TAC小鼠心肌组织中NF-κB活性 图1显示，小鼠TAC 2周后，心肌组织中NF-κB活性明显增加，与假手术组相比上升了128.1% (6.16±0.98 VS. 2.70±0.63,n=10,P＜0.01］，给予PDTC可以抑制心肌组织中NF-κB活性的增加，与TAC模型组相比降低了34.3%(4.05±1.06 VS. 6.16±0.98,n=10,P＜0.01)，提示PDTC具有抑制压力负荷诱导的心肌组织中NF-κB活性增加的作用。
Sham＝假手术组，TAC＝TAC模型组，TAC+PDTC＝PDTC处理组。nb＝非特异结合
图1 PDTC抑制肥大心肌组织中NF-κB活性 略
2.3 PDTC对TAC小鼠心肌组织中GSK3β（Ser9）磷酸化的影响 图2显示，小鼠TAC 2周后，心肌组织中GSK3β（Ser9）的磷酸化增加，与假手术组相比p- GSK3β(Ser9)/GSK3β比值上升了35.1%(0.77±0.08 vs. 0.57±0.12, n=10,P＜0.01)。给予PDTC其p-GSK3β(Ser9)/GSK3β比TAC模型组降低了22.1%(0.60±0.18 vs 0.77±0.08，n=10,P＜0.05)。
图2 PDTC对心肌组织中p-GSK-3β和GSK-3β蛋白表达水平的影响 略
3 讨论
本研究发现缩窄小鼠主动脉弓2周后，其心脏重量/体重比值增加，同时心肌组织中NF-κB的结合活性和GSK3β（Ser9）磷酸化水平增加。给TAC小鼠腹腔注射NF-κB抑制剂PDTC能明显地抑制心肌组织中NF-κB活性和GSK3β（Ser9）磷酸化水平，并减轻心肌肥大的发展。这些结果表明，PDTC可以通过抑制NF-κB结合活性和GSK3β（Ser9）磷酸化水平延缓心肌肥大的发生发展。
触发心肌肥大的反应与多种信号通路的激活有关，包括钙调神经磷酸酶(Calcineurin)、丝裂素活化蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase，MAPK) 、钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶(Calcium calmodulin-dependent protein kinases, CaMK)、磷酸肌醇3-激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/ 蛋白激酶B(PKB, protein kinase B, Akt)和核因子-κB（nuclear factor kappa B ，NF-κB）等［2，3，7］。以体外培养心肌细胞为模型的研究和我们的动物在体实验表明NF-κB信号通路在心肌肥大的发生发展中起着关键作用［2，3，5］。但目前仍不清楚在心肌肥大发生发展过程中NF-κB是如何被激活的。NF-κB是Rel蛋白家族成员，主要由p50和p65（RelA）两个亚单位组成。NF-κB结构中都有约300个氨基酸组成的Rel同源区，内含与DNA结合、二聚体化及核易位有关的关键序列。在绝大多数细胞中，NF-κB二聚体与抑制蛋白IκB结合，以无活性的形式存在于胞浆中。NF-κB p65（RelA）的磷酸化与NF-κB核易位和活化密切相关。近年来的研究发现糖原合成激酶-3β(Glycogen Synthase Kinase-3β,GSK3β)可以影响NF-κB p65（RelA）亚单位的磷酸化，从而抑制NF-κB活化［8］。因此我们推测GSK-3β可以通过调控NF-κB活性而参与心肌肥大的发生发展。在本研究中，我们观察到缩窄主动脉弓的小鼠心肌组织中，NF-κB的结合活性显著升高，同时GSK3β（Ser9）磷酸化水平也明显增加。Hardt等也发现GSK3β激酶在正常情况下，可抑制细胞的生长,当GSK3β Ser9被磷酸化后，GSK3β激酶的活性降低，从而解除其对细胞生长的抑制作用而促进心肌肥大的发展［9］。
PDTC是具有抗氧化作用的稳定化合物，被广泛用于抑制NF-κB活性，但其抑制NF-κB激活的机制尚未阐明。有研究报道PDTC通过其抗氧化作用抑制NF-κB活性［4，5］，但Hayakawa等报道PDTC抑制NF-κB活性与抗氧化功能无关［6］。本研究发现PDTC能同时抑制心肌组织中NF-κB活性和GSK3β（Ser9）磷酸化水平，并使心脏重量/体重比值回降，这提示PDTC可以通过抑制NF-κB结合活性和GSK3β（Ser9）磷酸化水平延缓心肌肥大的发生发展。由于GSK-3β激酶可以影响NF-κB p65（RelA）的磷酸化，从而抑制NF-κB活化［8］，因此PDTC可能通过抑制GSK3β（Ser9）磷酸化使GSK3β激酶的活性增加，从而抑制NF-κB活性并延缓心肌肥大的发生发展。当然其确切机制还需进一步的研究来证实。
【参考文献】
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3 李跃华，哈团柱，陈琪,等.MyD88依赖性NF-κB信号途径在心肌肥大发生过程中的调控作用. 中华医学杂志，2005，85:267-272.
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6 Hayakawa M, Miyashita H, Sakamoto I, et al.Evidence that reactive oxygen species do not mediate NF-kappa B activation.EMBO J，2003，22:3356-66.
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9 Hardt SE,Sadoshima J. Glycogen synthase kinase-3: a novel regulator of cardiac hypertrophy and development. Circ Res，2002，90:1055-1063.
作者单位： 210029 江苏南京，南京医科大学病理生理学系
(编辑：秋 实)