点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨大鼠灌胃布洛芬与盐酸苯丙醇胺重复给药的毒性作用，提供毒性反应靶器官及其损害的可逆性确定无毒反应剂量。方法 Wistar大鼠150只，分成5组，每组30只，雌雄各半。布洛芬（IBU）与盐酸苯丙醇胺（PPA）伍用设高、中、低3个剂量组。高剂量组（IBU 384mg/kg＋PPA 64mg/kg）相当于人拟用剂量19.2倍。中剂量组（IBU 96mg/kg＋PPA 16mg/kg）相当于人拟用剂量4.8倍。低剂量组（IBU 24mg/kg＋PPA 4mg/kg）相当于人拟用量1.2倍。另设布洛芬（384mg/kg）对照组和溶剂对照组。结果 布洛芬对照组和高剂量组动物给药后均表现出食物消耗量明显减少、体重减轻、体重增长抑制、活动减少、精神不振、运动失调、瘫软、消瘦。少数动物腹部皮毛有尿染，排咖啡色软便，这两组动物均在给药D3～D6内死亡，对死亡动物或濒死动物尸检，可见腹水，肠粘连，肝、脾包膜明显增厚，呈典型的急性化脓性腹膜炎表现。所有死亡动物和濒死动物均可见脾红髓淋巴组织增生及被膜急性化脓性炎症，肠壁浆膜和肌层也可见到急性化脓性炎症。个别动物胸腺明显萎缩，皮质淋巴细胞减少，皮髓质倒置。中剂量组有1只雌鼠在给药D17时死亡，死亡动物鼻周围有少量有色分泌物。该组雄鼠给药第1、2、4周食物消耗量减少，在给药期间出现体重减轻、体重增长抑制现象，在给药结束后逐渐恢复正常。雌鼠给药第1周时食耗明显减少。给药第1～2周时出现体重增长抑制现象。病理检查发现脑和脾脏的脏器系数增加。血液学检查可见RBC、Hb和HCT降低。给药结束时（D28）血浆生化指标检查发现Glu明显降低，上述情况在恢复期结束时均恢复正常。恢复期结束时（D56）血浆TP和Alb明显下降。低剂量组大鼠脾脏、雄鼠脑以及雌鼠卵巢的脏器系数显著降低，药后D28时RBC、Hb、HCT和D56 Glu与同期溶剂对照组比较差异有显著性（P＜0.05）。各组尿液检查未见明显异常改变。结论 在本实验室本次实验条件下，布洛芬在相当于人拟用剂量19.2倍（384mg/kg）时引起实验大鼠100％死亡。布洛芬24mg/kg与盐酸苯丙醇胺4mg/kg伍用，未见明显毒性改变。
【关键词】 布洛芬； 盐酸苯丙醇胺；联合用药；重复给药毒性；Wistar大鼠； 长期毒性；安全评价；灌胃
布洛芬与盐酸苯丙醇胺配伍用是一种拟用于治疗感冒的新药。本实验的目的是评价Wistar大鼠灌胃布洛芬与盐酸苯丙醇胺产生的毒性作用， 提供毒性反应的靶器官及其损害的可逆性，确定无毒反应剂量， 为制订人临床用药方案提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 供试品与对照品
1.1.1 供试品名称、代号、缩写 布洛芬与盐酸苯丙醇胺，布洛芬代号为IBU，盐酸苯丙醇胺代号为PPA。
1.1.2 批号 布洛芬批号为00080305，盐酸苯丙醇胺批号为99120731。
1.1.3 含量或纯度 布洛芬99.74%；盐酸苯丙醇胺100.3%。
1.1.4 理化性质 白色结晶性粉末。盐酸苯丙醇胺易溶于水；布洛芬不易溶于水。
1.1.5 供试品稳定性和保管 放入保险柜内置室温下保存。
1.1.6 登记程序 每次取供试品的数量、日期、使用人员、使用目的都登记在案，研究结束后，剩余的供试品送还委托单位。
1.1.7 溶剂 1%羧甲基纤维素液。
1.1.8 配制方法 根据动物体重计算所需药量，称取适量的布洛芬与盐酸苯丙醇胺加入所需溶剂配成混悬液，每天临用前配制。使用时混匀。
1.2 研究系统
1.2.1 实验动物 Wistar大白鼠， 雌、雄性各75只，6～8周龄，体重160～180g。二级动物，购于军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号： BDW 95012。
1.2.2 研究系统选择说明 Wistar大鼠是毒理学研究中公认的标准动物之一。我国“药品注册管理办法”推荐使用该种动物。委托方同意使用该种动物。
1.2.3 研究系统标记程序 动物到达后，按相应SOP的要求接收。给每只动物确定一个独立的检疫流水号。分组时为每只动物指定一个单一的研究动物号。动物及笼卡上标明动物号。原始资料中使用研究动物号来识别。
1.2.4 饲养条件 动物饲养于二级动物房内，由获得资格认可的人员饲养。动物房挂温湿度计，每天早8：30～9：00时测定记录1次。室温控制在(23±5)℃，湿度(60±20)%，12h照明，12h黑暗。每天清洁笼子1次。
1.2.5 检疫过程 所有动物将按SOPA035要求，检疫观察1周， 在此时间内， 观察动物的疾病和死亡指征， 任何异常现象都需向专题负责人和临床兽医报告。动物在使用前需经临床兽医检查和专题负责人认可。发现任何有病的动物在实验动物选择时进行剔除。若在给药前出现病态， 须在专题负责人指导下用一健康动物进行代替。
1.2.6 饲料 用总院实验动物中心提供的标准膨化饲料喂养。自由摄食，采血样前禁食约16h。
1.2.7 饮用水 用饮水瓶供应自来水，由动物自由饮用。不再用氯气或HCl对水进行处理。
1.3 实验设计
1.3.1 试验设计的依据［3］ (1)委托单位提供的急性毒性资料：小鼠灌胃的LD50为1572.6mg/kg。腹腔注射LD50为438.9mg/kg。(2)委托单位提供的药效学资料：镇痛实验，小鼠口服有效剂量为140、280和560mg/kg；解热实验，小鼠口服有效剂量为1.4mg/kg；抗炎实验，小鼠腹腔注射有效剂量为60和120mg/kg。布洛芬与盐酸苯丙醇胺用药剂量按6∶1配伍。(3)委托单位提供的临床试用方案： 拟用剂量为布洛芬300mg＋盐酸苯丙醇胺50mg/粒。1～2粒/次，间隔12h。疗程＜7天。口服。(4)采用标准： 我国卫生部颁布的《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》［1］和药品监督管理局颁布的《药品注册管理办法》［2］中有关规定。
1.3.2 实验分组 根据试验目的和试验设计要求，本次试验设布洛芬与盐酸苯丙醇胺配伍用低、中、高3个剂量组，另设溶剂对照（1%羧甲基纤维素液）和布洛芬384mg/kg对照各1组。每组剂量及其与人拟用剂量倍数的关系见表1。
表1 大鼠灌胃布洛芬与盐酸苯丙醇胺重复给药 略
1.3.3 供试品给予途径和次数 给药途径为灌胃，药体积1ml/100g体重，每日上午8：30～10：30时给药，给药期限为每天1次，每周给药7天，连续给药4周。
1.3.4 给予供试品的途径说明 委托单位指定的给药途径为口服，与人临床拟用途径相同。
1.3.5 供试品及对照品的配制 根据动物体重计算所需药量，称取所需布洛芬与盐酸苯丙醇胺加入适量的溶剂中，根据每组鼠体重总量配制不同的量和浓度。每天临用前配制1次。
1.3.6 供试品的给予 用5ml注射器（连接灌胃针头）抽取药液，按相应SOP进行操作。
1.3.7 观察、检验、分析和测量的指标与次数 (1)主要检测仪器：日立7020自动生化分析仪 (日立公司，日本)； AVL-9130钠钾氯分析仪(美国)； 多参数血细胞计数分析仪 (JT-IR，美国)。(2)观测的指标和时间：见表2。(3)恢复性观察：最后一次给药后24h， 每组雌、雄各活杀10只进行血液学、血液生化及病理学检查。留下的动物继续观察1个月时再活杀， 以便了解毒性反应的恢复情况和可能出现的延迟性毒性。(4)统计分析：在不同性别组别中， 对食耗、体重、血液学、临床化学、器官重量、脏器系数进行方差分析。如果F值有显著差别(P≤0.05)， 则用“t”检验来进行组间比较。(5)计算机应用：本项研究采用本中心自行编制的计算机应用软件，对试验中的动物进行随机分组、称重和给药量计算，进行食耗测定、笼旁观察等数据的采集及统计处理。
表2 观测指标和时间观察指标 略
2 结果与讨论
2.1 动物饲养管理情况 将检疫合格的大鼠按体重随机分组，分笼饲养，每笼5只。自由摄食、饮水。在实验期间室温控制在(23±5)℃，湿度为(50±20)％，动物身体健康，没有发生意外疾病。
2.2 一般生理指标观察
2.2.1 笼旁观察 给药期间，高剂量组雌雄大鼠均在给药D3～D6内死亡，布洛芬对照组雌鼠均在给药D3～D5内死亡，布洛芬对照组雄鼠均在D4～D6内死亡。中剂量组1只雌鼠在给药D17时死亡，鼻周围有少量有色分泌物。动物死亡时间多发生在夜间和下午。动物死亡前活动减少、精神不振、运动失调、瘫软、消瘦、腹部皮毛有尿染，个别动物有咖啡色软便。动物尸解可见腹水、肠粘连。
低剂量组动物行为活动正常，无异常外观体征。粪便颜色、形状、数量正常。未发现与给药有关的异常症状。
2.2.2 体重 试验期间各组动物体重及体重变化见图1～图4。结果表明，给药第2～4周，中、低剂量组雄鼠体重减轻，与溶剂对照组比较差异有非常显著性(P＜0.01)。
图1 － 图4 略
给药第1～4周，中剂量组雌鼠体重减轻，与溶剂对照组比较差异有非常显著性(P＜0.01)。中剂量组雄鼠给药第1～4周、雌鼠给药第1～2周出现体重增长抑制现象，低剂量组雄鼠给药第2周和第4周也呈现体重增长抑制现象，与溶剂对照组比较差异有非常显著性(P＜0.01)。提示在此剂量时对大鼠体重增长有一定影响。但这种改变是可恢复的。
2.2.3 食物消耗量 试验期间各组动物食物消耗量见图5、图6。结果表明，给药第1周，布洛芬对照组及高剂量组雄鼠食物消耗量明显减少，与溶剂对照组比较差异有非常显著性(P＜0.01)。中剂量组雄鼠给药第1、2、4周食物消耗量减少，与溶剂对照组比较差异有显著性(P＜0.05)。低剂量组雄鼠给药第2、4周有食物消耗量减少趋势。
图5 － 图6 略
布洛芬对照组及高、中剂量组雌鼠给药第1周食物消耗量明显减少，与溶剂对照组比较差异有非常显著性（P＜0.01）。
低剂量组动物食物消耗量减少仅属个别时间点的变化，与溶剂对照组比较差异无显著性（P＞0.05）。停药后恢复正常。
2.3 血液学和血液生化指标检查
2.3.1 血液学指标变化 布洛芬对照组（Ⅱ组）和IBU＋PPA高剂量组（Ⅲ组）动物在给药期间不同时间全部死亡，未能取样作血液学和血液生化测定。中剂量组（Ⅳ组）和低剂量组（Ⅴ组）动物药后D28，RBC、Hb和HCT三项指标与溶剂对照（Ⅰ组）动物相比显著降低（P＜0.05～0.01），但这种降低是可恢复的，停药后28天（D56）基本恢复正常（表3～表5）。其他血液学指标未观察到能说明被试药物毒性反应有关的异常变化。
2.3.2 血浆生化指标变化 见表6。从表6可见，中剂量组动物药后D56，血浆TP、Alb与同期对照比明显降低（P＜0.05～0.01），该组雄性动物BUN与本试验对照（Ⅰ组）比，有增高趋势（P＜0.01）。个体分析表明，该组动物的BUN值，均在本实验室建立的Wistar大鼠（♂）BUN正常参考值(485～11.11mmol/L)范围内，故该组动物（♂）BUN的统计学上的这种变化似无重要的毒理学意义。
中剂量组（Ⅳ组）和低剂量组（Ⅴ组）♂鼠药后D28，血浆Glu与同期对照比，显著降低，且似有剂量依赖关系存在，Ⅳ组♂鼠Glu的降低程度大于Ⅴ组♂鼠（表7）。其他血液生化指标未观察到能说明被试药物毒性反应的异常改变。
2.3.3 尿液指标的变化 IBU＋PPA复方中剂量组和低剂量组动物药后D28，尿NIT、pH、Glu、PRO、BLD、KET、BIL和URO等8项指标定性检查结果与同期溶剂对照组动物比，未见明显异常变化（表8）。
2.4 病理组织学检查
2.4.1 肉眼检查 给药后死亡和濒死动物尸检，布洛芬对照组和高剂量组各有2只动物给药后4天死亡做了尸检，发现肝、脾包膜明显增厚，其中布洛芬对照组还发现1只大鼠胃壁溃烂，腹腔内充满大量淡黄色腹水。布洛芬对照组2只大鼠和高剂量组1只大鼠于给药后6天濒死时活杀做了尸检，发现布洛芬对照组1只大鼠有大量腹水和广泛重度肠粘连，另外2只大鼠可见局部轻度肠粘连。中、低剂量组给药期和恢复期活杀动物未见异常。
2.4.2 显微镜检查 给药后死亡和濒死动物检查发现，布洛芬对照组1只濒死大鼠活杀后检查，发现胸腺明显萎缩，皮质淋巴细胞减少，皮髓质倒置。所有死亡和濒死动物均可发现脾红髓淋巴组织增生和被膜急性化脓性炎症，肠壁浆膜和肌层也可见到急性化脓性炎症。中剂量组给药结束和恢复期活杀动物检查未见异常。
2.4.3 脏器系数 见表9、表10。给药结束活杀动物，中、低剂量组雄性大鼠体重比对照组显著降低。脏器系数显著增加的有中剂量组雌雄性大鼠脑、脾，雌性大鼠肾和低剂量组雄性大鼠脑。脏器系数显著降低的有低剂量组雌雄大鼠脾。恢复期活杀动物，低剂量组雌性大鼠卵巢脏器系数显著降低。
表3 大鼠灌胃布洛芬与盐酸苯丙醇胺长期毒性试验血液学检验结果 （略）
表4 大鼠灌胃布洛芬与盐酸苯丙醇胺长期毒性试验血液学检验结果 （略）
表5 大鼠灌胃布洛芬与盐酸苯丙醇胺长期毒性试验血液学检验结果 （略）
表6 大鼠灌胃布洛芬与盐酸苯丙醇胺长期毒性试验生化学指标检验结果 （略）
表7 大鼠灌胃布洛芬与盐酸苯丙醇胺长期毒性试验生化学指标检验结果 （略）
表8 Wistar大鼠灌胃布洛芬与盐酸苯丙醇胺毒性试验尿液检验结果 略
表9 雄鼠灌胃布洛芬与盐酸苯丙醇胺重复给药试验脏器系数 (略)
表10 雌鼠灌胃布洛芬与盐酸苯丙醇胺重复给药试验脏器系数 (略)
2.4.4 病理结果评价 高剂量IBU或高剂量IBU＋PPA重复灌胃给药可引起大鼠急性化脓性腹膜炎。中剂量IBU＋PPA重复灌胃给药4周，大鼠内脏器官和脑组织无明显病理变化。中剂量组给药结束时活杀，大鼠脑、脾的脏器系数显著增加，停药后1个月即可恢复。
2.5 眼科检查 在给药结束（D28）及恢复期结束（D56）检查动物未发现眼睑、结膜、角膜、前房、虹膜、瞳孔、晶体、眼底异常改变。
3 结论
综上所述，在本实验室本次实验条件下，布洛芬在相当于人拟用剂量19.2倍（384mg/kg）时引起实验大鼠100％死亡。布洛芬24mg/kg与盐酸苯丙醇胺4mg/kg伍用，未见明显毒性改变。
【参考文献】
1 中华人民共和国卫生部药政局.新药（西药）临床前研究指导原则汇编（药学、药理学、毒理学），1993，202-203.
2 国家药品监督管理局.药品注册管理办法，2002.
3 王治乔，袁伯俊.新药临床前安全性评价与实践.北京：军事医学科学出版社，1997，43-62.
作者单位：1 100050 北京，中国医学科学院中国协和医科大学新药安全评价研究中心
2 100850 北京，军事医学科学院毒物药物研究所
(编辑：宋 冰)