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Home医源资料库在线期刊中华医学研究杂志2005年第5卷第12期

小鼠Tnfaip1基因的克隆、表达及抗体制备

来源:中华医学研究杂志
摘要:【摘要】目的克隆小鼠Tnfaip1基因,并在大肠杆菌中表达,通过免疫新西兰兔,获得小鼠Tnfaip1多克隆抗体,为进一步研究小鼠Tnfaip1的功能奠定基础。方法用RT-PCR方法从小鼠肝脏组织中扩增获得Tnfaip1基因的蛋白质编码区,将目的片段连接到PMD18-T载体,然后亚克隆至pGEX-4T-2中,进而在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋......

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     【摘要】  目的  克隆小鼠Tnfaip1基因,并在大肠杆菌中表达,通过免疫新西兰兔,获得小鼠Tnfaip1多克隆抗体,为进一步研究小鼠Tnfaip1的功能奠定基础。方法  用RT-PCR方法从小鼠肝脏组织中扩增获得Tnfaip1基因的蛋白质编码区,将目的片段连接到PMD18-T载体,然后亚克隆至pGEX-4T-2中,进而在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白质GST- Tnfaip1,并用其免疫新西兰兔,获得小鼠Tnfaip1多克隆抗血清。结果  得到了小鼠Tnfaip1多克隆抗体。结论  成功得到了特异性好的、效价高的小鼠Tnfaip1多克隆抗体。

  【关键词】  克隆;Tnfaip1;表达;多克隆抗体
  
  Cloning and expression of mouse Tnfaip1 and preparation of its polyclonal antibody

  LIU Xin,HAN Mei.

  Laboratory of Gene Knock-out and Transgenic Animal,College of Life Science,Hunan Normal University,Changsha,Hunan 410081,China

 【Abstract】  Objective  Cloning mouse Tnfaip1 and  expressing its protein in E.coli and preparing the polyclonal antibody by immunizing the rabbit to pave the way for understanding the role of Tnfaip1.Methods  The Tnfaip1 cDNA was amplified from mouse liver tissue by RT-PCR,and cloned into pMD18-T vector.  Correct clone was confirmed by DNA sequencing. It was then subcloned into expression vector pGEX-4T-2 to express fusion protein GST -Tnfaip1 in E.coli. and the purified fusion protein was used to immunize New Zealand rabbits.Results  Polyclonal antibody against Tnfaip1 was obtained by immunizing the rabbits.Conclusion  High levels of specific polyclonal antibody against Tnfaip1 was obtained successfully.

  【Key words】  clone;Tnfaip1;expression;polyclonal antibody

    Tnfaip1是受TNF-α诱导的基因[1],而TNF-α是一个多功能的细胞因子,在细胞凋亡、细胞增殖、B细胞激活以及一些急性的细胞炎症反应等都起重要作用[2],TNF-α在肝脏修复过程中也起关键性的作用[3,4]。Tnfaip1基因已被证实与增殖细胞核抗原(PCNA)和DNA聚合酶δ小亚基(P50)直接相互作用[5],而PCNA和 P50 在DNA复制、细胞周期调控等一系列细胞生理过程中发挥着重要的作用[6~10]。在老年痴呆症转基因线虫模型中发现,Tnfaip1表达显著上调,推测Tnfaip1起着保护海马神经元免遭β淀粉样蛋白对DNA 损伤作用,揭示Tnfaip1可能在TNF-α的信号传导中起着关键的中间桥梁作用,在DNA的损伤修复中可能发挥重要作用[11]。从已有的文献和与Tnfaip1基因具有高度同源的PDIP1基因的研究[12] 及Tnfaip1基因的结构,推测Tnfaip1 作为一种受TNF-α诱导的蛋白,可能在TNF-α所介导的包括细胞凋亡、肝脏修复在内的一系列信号传导途径中起作用,在DNA的复制、修复以及细胞周期的调控起重要作用,有可能是TNF-α信号传导通路的组成部分,也可能是作为这些途径作用的下游靶标。目前,对这个基因还只是一个初步的认识,通过对小鼠的Tnfaip1基因的克隆和表达以及抗体的制备,为Tnfaip1基因的功能研究奠定了基础。

  1  材料与方法

  1.1  小鼠Tnfaip1基因的克隆

  1.1.1  小鼠肝脏组织总RNA的提取 

  按照传统的异硫氰酸胍一步法[13]从2月龄的SPF级CD-1小鼠(南华大学实验动物学部提供)肝脏组织提取总RNA。所提取的RNA的浓度和纯度用Eppendorf公司的蛋白质核酸检测仪进行分析。

  1.1.2  mRNA的分离 

  用Oligotex mRNA Kit(Qiagen公司)提取mRNA,操作按试剂盒说明书略加改进进行。

  1.1.3  RT-PCR 

  采用Qiagen公司的Sensiscript RT Kit,以所提取的CD-1小鼠的肝脏mRNA为模板,按照试剂盒中提供操作说明,反转录合成cDNA的第一条链。

  根据GenBank的小鼠Tnfaip1基因序列(accession number:BC003906),用DNAstar软件设计引物:PF:5’-ACGTCGACTATGTCAGGGGACACCTGTCTG-3’(下划线为SalⅠ酶切位点)和 PR:5’-TTGCGGCCGCTCAGTCACGATGAGTGGACTG-3’(下划线为NotⅠ酶切位点)(由上海生工合成),然后以合成的cDNA作为PCR反应扩增的模板,94℃预变性2 min,94℃ 20 sec,62℃ 40 sec,72℃ 60 sec,扩增32个循环,72 ℃延伸10 min,置4℃结束反应。PCR产物通过1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测,特异性条带经Qiagen回收试剂盒纯化分离后,连接至pMD18-T(TaKaRa)中,在涂有X-gal和IPTG的氨苄LB平板进行蓝白斑筛选,阳性克隆送测序(由上海生工测序)。

  1.2  小鼠Tnfaip1基因的表达

  1.2.1  表达载体的构建 

  将pMD18-T-Tnfaip1用SalⅠ和NotⅠ酶切后,连接到用SalⅠ和NotⅠ双酶切pGEX-4T-2 (Amersham Pharmacia) 载体中,获得表达载体pGEX-4T-2-Tnfaip1。

  1.2.2  小鼠GST-Tnfaip1融合蛋白的表达和纯化 

  按Pharmacia公司提供的操作方法进行,将表达载体pGEX-4T-2-Tnfaip1转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)中,从2YT培养平板(含100mg/ml Amp)中筛选出正确的单克隆,接种到3 ml的2 YT培养基中,37℃过夜培养,然后按1:100扩大培养,37℃培养至OD600=1.0时,加入IPTG至终浓度0.1 mM,在17℃,150rpm的摇床中诱导培养8h。4℃,4000g离心,收集菌体,加入Lysis buffer(1×PBS,10mMDTT,1mM PMSF,200μg/ml lysozyme)重悬,加入20%的Triton X-100,用超声波将细胞充分破碎,16000g,4℃离心20min,用谷胱甘肽Sepharose 4B 进行亲和层析来纯化GST-Tnfaip1融合蛋白,通过10% SDS-PAGE分析表达纯化效果。
同时将pGEX-4T-2空白载体转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3),表达GST蛋白。

  1.3  小鼠Tnfaip1多克隆抗体的制备
 
  选用Ⅰ级新西兰兔(体重2kg,南华大学实验动物学部提供)进行免疫,按文献[14]方法进行,免疫前采空白血清,首次免疫,每只用1ml  GST-Tnfaip1融合蛋白(400μg)与1ml的弗氏完全佐剂(Sigma)充分混匀,皮下多点注射。之后,在第4周、第5周、第6周加强免疫三次,第7周耳中央动脉采血,取血清。

  1.4  Western印迹 

  按文献[13]方法进行,以GST作阳性对照,将GST-Tnfaip1融合蛋白和CD-1小鼠的肝和脑组织的蛋白提取液跑10% SDS-PAGE,再转PVD膜,用含10%脱脂牛奶TTBS封闭(100 mmol/L Tris.Cl,pH=7.5  0.9% w/v NaCl  0.1% v/v Tween20),以抗血清(1:200,1:500,1:1000稀释)为一抗,羊抗兔IgG-HPR(1:1000)为二抗进行杂交,DAB显色。同时用空白血清为一抗作阴性对照。

  2  结果

  2.1  小鼠肝脏组织总RNA的提取 

  将提取的总RNA进行凝胶电泳,所得的电泳图如图1(略)。

  2.2  RT-PCR 

  根据小鼠Tnfaip1在GenBank中公布的序列,同时为保证以正确的阅读框克隆到pGEX-4T-2中表达正确的GST-Tnfaip1融合蛋白,设计了一对特异引物,并在上游引物5’增加了SalⅠ酶切位点,在下游引物的5’增加了NotⅠ酶切位点,从合成的小鼠cDNA中扩增到了950 bp左右的片段如图2所示,切胶回收纯化后,连接到pMD18-T中,阳性克隆经测序与GenBank公布的小鼠Tnfaip1开放阅读框序列完全一致。

  2.3  表达载体的构建 

  将pMD18-T-Tnfaip1亚克隆至pGEX-4T-2 载体中,获得表达载体pGEX-4T-2-Tnfaip1。用EcoRⅠ酶切验证,得到730bp左右的片段,见图3。

  2.4  小鼠GST-Tnfaip1融合蛋白的表达和纯化 

  用谷胱甘肽Sepharose 4B 进行亲和层析纯化表达的GST-Tnfaip1融合蛋白,通过10% SDS-PAGE分析,可见在63 KD处有一条比较纯的表达带,与预期大小一致,见图4。

  2.5  Western印迹 

  以获得的小鼠Tnfaip1抗血清作一抗按1:200,1:500,1:1000三个稀释度,作Western 印迹分析,1:500还能检测到在分子量为63KD的GST- Tnfaip1融合蛋白和肝、脑组织中36KD左右有一条特异印迹带,见图5和图6所示。空白血清未检测到相应的带(结果未显示)。用GST抗体检测到27 KD的GST蛋白和63KD的GST-Tnfaip1融合蛋白,说明整个表达系统和Western blot没问题。

  3  讨论

  GST融合蛋白体外表达系统是一种高效表达系统,在Tac启动子操纵下,表达效率很高;载体中的氨苄青霉素抗性基因为克隆的筛选提供了方便;连有GST的融合蛋白很容易用谷胱甘肽Sepharose 4B进行亲和层析纯化。但表达的条件要依不同的蛋白而需进行优化,针对不同的蛋白,其IPTG的浓度、诱导的温度和时间不同,这样才可能提高蛋白在体外表达的效率和可溶性。抗体的制备按常规的方法进行,我们选择了皮下多点注射途径,这种途径更有利于快速抗体制备,而且效价高。除此之外,蛋白的抗原性、免疫的次数、以及免疫动物的质量都与抗体的特异性和效价有关,我们曾在加强免疫两次后测抗体,但滴度不高。特异性和效价高的小鼠Tnfaip1抗体的获得为研究Tnfaip1基因的功能,特别是在蛋白质水平的功能研究奠定了很好的基础。

  【参考文献】

  1  Wolf FW,Marks RM,Sarma V,et al. Characterization of tumor necrosis factor-α-induced protein endothelial primary response gene. J Biol Chem,1992,267: 1317-1326.

  2  W Fiers,R Beyaert,E Boone,et al. TNF-induced intracellular signaling leading to gene induction or to cytotoxicity by necrosis or by apoptosis.Inflamm,1995,47: 67-75.

  3  G K Michalopoulos,M C DeFrances. Liver regeneration. Science,1997,276: 60-66.

  4  N Fausto.Liver regeneration. J Hepatol,2000 (suppl),32: 19-31.

  5  Jianlin Zhou,Xiaoxiao Hu,Xiwen Xiong,et al. Cloning of two rat PDIP1 related genes and their interactions with proliferating cell nuclear antigen. Journal of Experimental Zoology,2005,303A:227-240.

  6  G Prelich,CK Tan,M Kostura,et al. Functional identity of the proliferating cell nuclear antigen and a DNA polymerase auxiliary protein. Nature,1987,326: 517-520.

  7  TS Krishna,XP Kong,S Gary,et al. Crystal structure of the eukaryotic DNA polymerase processivity factor PCNA. Cell,1994,87: 1233-1243.

  8  JM Gulbis,Z Kelman,J Hurwitz,et al. Structure of the C-terminal region region of p21 WAF1/CIP1 complexed with human PCNA. Cell, 1996,87: 297-306.

  9  PS Kedar,SJ Kim,A Robertson,et al. Direct interaction between mammalian DNA polymerase β and proliferating cell nuclear antigen. J Biol Chem,2002,277: 31115-31123.

  10  T Tsurimto. PCNA binding proteins. Front Biosci,1999,4: 849-858.

  11  Link CD,Taft A,Kapulkin V,et al. Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegens Alzheimer's disease model. Neurology of Aging,2003,24:297-413

  12  He H,Tan CK,Downey KM,et al. A tumor necrosis factor-and interleukin 6-inducible protein that interacts with the small subunit of DNA polymerase and proliferating cell nuclear antigen. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98: 11979-11984.

  13  F奥斯伯.精编分子生物学实验指南.颜子颖,王海林等译.北京:高等教育出版社,1998.

  14  Ed Harlow,David Lane.Antibodies:A Laboratory Manual,1st ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988.

  作者单位:1 410081 湖南长沙,湖南师范大学生命科学学院基因敲除与转基因动物研究室

       2 421001 湖南衡阳,南华大学生命科学与技术学院(Δ通讯作者)

  (编辑:守  中)

 

作者: 刘鑫,韩梅 2006-8-19
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