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【摘要】 目的 建立动态浊度法，研究角膜真菌感染的检测。方法 分别测定葡聚糖标准品、内毒素标准品、真菌标准株(烟曲菌、串珠镰刀菌和茄病镰刀菌)及细菌标准株(绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌)，测定19例临床标本。结果 葡聚糖的浓度时间曲线为双曲线，时间反应曲线显示反应速率较低。内毒素的浓度时间曲线为直线，时间反应曲线显示反应速率较高。三种真菌的浓度时间曲线和时间反应曲线与葡聚糖的相似，革兰阴性菌（绿脓杆菌）的浓度时间曲线和时间反应曲线与内毒素的相似，革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌）没有反应。临床19例标本，根据其浓度时间曲线和时间反应曲线的形态，11例确诊为真菌感染，8例为革兰阴性细菌曲线，为真菌和细菌的混合感染。结论 动态浊度法可用于角膜真菌感染的检测，但对细菌-真菌混合感染不能确诊。
【关键词】 动态浊度法；真菌；角膜；葡聚糖
Establishment of the turbidimetric kinetic assay and measurement of fungus-infected corneal specimens
LIU Hong-wei，WANG Xiang-lan，PENG Shu-ling，et al.
Department of Pharmacology，Beijing Institute of Ophthalmology，Beijing Tongren Ophthalmology Center，Beijing Tongren Hospital，Capital University of Medical Sciences，Beijing 100730，China
【Abstract】 Objective To establish the turbidimetric kinetic assay and study the measurement of fungus infection in corneal specimen.Methods Glucan，endotoxin，fungus(Aspergillus fumigatus，Fusariun moniliforme and Fusariun solani) and bactiria(Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureaus) were measured.19 clinic specimens were also measured.Results The concentration-time curve of glucan was hyperbola and its time-reaction curve had low reaction rate.The concentration-time curve of endotoxin was beeline and its time-reaction curve had high reaction rate.The concentration-time curve and time-reaction curve of 3 fungi were same as that of glucan.The concentration-time curve and time-reaction curve of G- bacterium(Pseudomonas aeruginosa) were as same as that of endotoxin.The G+ bacterium(Staphylococcus aureaus) had no reaction.According the concentration-time curve and time-reaction curve，11 specimens were diagnosed fungi and 8 specimens were co-infection of fungi and bacteria.Conclusion Fungi infection in cornea could be diagnosed by turbidimetric kinetic method.Co-infection of fungi and bacteria could not be diagnosed by this method.
【Key words】 turbidimetric kinetic method;fungus;cornea;glucan
角膜真菌感染的诊断较难，如不能及时治疗，对患者造成损害，因此快速诊断非常必要。真菌的诊断一般采用镜检和培养的方法，镜检较快，但漏检率较高，真菌培养的方法，检出率较高，但时间较长。我们使用鲎试剂与真菌的葡聚糖反应的原理，建立动态浊度法并对角膜标本进行真菌测定。
1 材料与方法
1.1 试剂
葡聚糖标准品(031222，规格：300μg/ml)，鲎试剂（批号040532，灵敏度：0.25Eu/ml）购自厦门鲎试剂厂，内毒素标准品（批号2002-7）和检测用水(批号2003-3)购自中国药品生物制品检定所。
1.2 仪器
BET-72细菌内毒素测定仪、振荡器（天津大学无线电厂），超声波处理器、离心机（Beckman公司）。
1.3 葡聚糖和内毒素的浓度-时间曲线
1.3.1 葡聚糖
将其倍比稀释为100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和 0.20μg/ml，取其200μl加入100μl鲎试剂，振荡30s，放入BET-72细菌内毒素测定仪测定，测定温度为(37±1)℃。
1.3.2 内毒素
将其10倍稀释为50、5、0.5、0.05和0.005EU/ml，按上述方法测定。
1.4 细菌、真菌标准株的测定
细菌包括革兰阴性菌(绿脓杆菌)和阳性菌(金黄色葡萄球菌)，真菌包括烟曲菌、串珠镰刀菌和茄病镰刀菌。在培养基上取少量菌落，加入1ml检测用水，超声波处理30min，2000cpm，10min，取上清。用检测用水将其按10倍稀释，分别取200μl加入100μl鲎试剂，振荡30s，BET-72细菌内毒素测定仪测定。
1.5 标本的处理
角膜标本来自北京普仁医院眼科，为临床确诊真菌性角膜炎后，进行角膜移植，将角膜标本用检测用水冲洗后，在洁净台中将其剪碎，加入1ml检测用水超声波处理30min，2000cpm，10min，取上清备用。
1.6 标本的测定和结果的确定
共检测临床诊断真菌的感染的角膜标本19例，标本处理后，用检测用水将其按10倍稀释8个稀释度，分别取200μl加入100μl鲎试剂，振荡30s，放入BET-72细菌内毒素测定仪测定。根据标本的浓度-时间曲线、时间反应曲线和时间速率曲线确定。
1.7 BET-72细菌内毒素测定仪的检测指标
内毒素或葡聚糖与鲎试剂中的B、C或G因子反应，形成凝胶，记录不同浓度的内毒素或葡聚糖在反应过程中不同时间的光密度值，确定OD值达到0.02的反应时间为测定反应时间，以反应时间为纵坐标，以药物浓度为横坐标，做图，成为浓度时间曲线。时间反应曲线为某一浓度的内毒素或葡聚糖在不同时间的OD值，以时间为横坐标，以样品的OD值为纵坐标，做图。时间速率曲线为某一浓度的内毒素或葡聚糖在不同时间的反应速率，以时间为横坐标，以样品的反应速率为纵坐标，做图。
2 结果
2.1 葡聚糖的浓度时间曲线
葡聚糖的浓度时间曲线为双曲线（图1），低浓度时，反应时间较长，随浓度的增加，反应时间减少，到达最低点后，反应时间随浓度的增高而增加。时间反应曲线显示，反应开始时，反应速率较低，曲线形态如“S”型。时间速率曲线显示，不同浓度的葡聚糖的最大反应速率大部分在1000～2000s的时间范围内。
2.2 内毒素的浓度时间曲线
内毒素的浓度时间曲线为直线（图2），反应时间随内毒素浓度的增高而减少。时间反应曲线显示，反应开始时，反应速率较高，曲线形态如同“倒L”型。时间速率曲线显示，不同浓度内毒素的最大反应速率大部分在500～1000s时间范围内。
2.3 真菌标准株的结果
烟曲菌、串珠镰刀菌和茄病镰刀菌的浓度时间曲线、时间反应曲线和时间速率曲线与葡聚糖的相似。
2.4 细菌标准株的结果
绿脓杆菌的浓度-时间曲线、时间反应曲线和时间速率曲线与内毒素的相似。金葡萄球菌不能做出浓度时间曲线、时间反应曲线和时间速率曲线。
2.5 临床标本的检测
检测的19例临床标本，根据浓度时间曲线、时间反应曲线和时间速率曲线，其中11例为真菌感染，有8例为细菌曲线，由于所有标本真菌培养阳性，为真菌和细菌混合感染。
3 讨论
真菌性角膜炎是严重的致盲眼病，主要以镰刀菌、曲霉菌、假丝酵母菌等感染为主［1，2］，近年发病率不断增多，发现戴软镜者［3］和激光手术后患者也有发病［4］，此病由于难以确诊（真菌培养需10天）延误治疗，以至引起失明，甚至丧失眼球。人们寻找快速诊断真菌感染的方法，鲎血提取液中的G-因子，可被真菌细胞壁特有成分(1～>3) beta-D-glucan（葡聚糖）激活后经过显色或凝集反应进行检测，可做真菌的定性和定量试验，称为G因子法。
动态浊度法已在2005版药典中用于对内毒素的测定［5］，它是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，我们用此方法分别测定内毒素标准品、葡聚糖标准品、真菌标准株及细菌标准株，并测定19例临床标本。临床标本是经培养确诊为真菌感染，根据我们实验的浓度时间曲线、时间反应曲线和时间速率曲线的形态，11例为真菌，8例为细菌的图形，可能为真菌和细菌的混合感染。8例不能确诊是由于鲎试剂中有G、B和C因子，B、C因子用于测定细菌，G因子用于测定真菌，细菌测定比真菌敏感，当两者混合时，只能测定出细菌。多粘菌素已用于抑制内毒素的凝集反应［6］，我们用多粘菌素来抑制BC因子的活性，由于多粘菌素纯度不高，混有内毒素，结果不理想。革兰阳性菌不影响检测，革兰阴性菌影响检测。
真菌的细胞壁较为坚固，我们对真菌标准品和临床标本处理时，采用超声的方法，以破坏真菌的结构。有学者从真菌中提取出葡聚糖［7］。
G因子法已用于测定间质性浆细胞肺炎血中的葡聚糖［8］，它可检测小鼠念珠菌病［9］和检测临床病人深层真菌感染［10］。
文献报道，1ng～1μg葡聚糖与G因子可产生凝集反应［11］，与我们的结果相似。 我们的实验显示产生反应的葡聚糖的浓度较高，为200ng～100μg，可能与鲎试剂的敏感性不同有关。真菌或含有真菌的标本以10倍稀释，至少有3～4个浓度凝集反应显著，而细菌在8个稀释度中都有反应，另外真菌和革兰阴性细菌的时间反应曲线和时间速率曲线不同，用此方法可检测标本的真菌感染。我们将进一步分离G和B、C因子，进行特异性反应，可排除细菌对真菌检测的影响。
【参考文献】
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10 Ostrosky-Zeichner，Alexander，Kett，et al.Multicenter clinical evaluation of the (1～>3) beta-D-glucan assay as an aid to diagnosis of fungal infections in humans.Clin Infect Dis，2005，41：654-659.
11 Tsuchiya，Takaoka，Tokioka，et al.Development of an endotoxin-specific Limulus amebocyte lysate test blocking beta-glucan-mediated pathway by carboxymethylated curdlan and its application.Nippon Saikingaku Zasshi，1990，45：903-911.
基金项目：北京市科技计划项目课题(编号：9555101700)
作者单位：100730 北京，首都医科大学附属北京同仁医院，北京同仁眼科中心，北京市眼科研究所药理室(△通讯作者)
(编辑：秋实)