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【摘要】 目的 评价构建的结核DNA疫苗pVS85BG免疫的小鼠体外产生细胞因子和抵抗结核分枝杆菌H37Rv攻击的能力。方法 利用基因操作技术将结核菌Ag85B基因和谷胱甘肽S转移酶基因插入pVAX1载体构建表达结核菌Ag85B和GST融合蛋白的DNA疫苗pVS85BG。将雌性C57BL/6小鼠分成5组，每组20只，分别用pVS85BG、pVAX1、pIL2S和PBS分别免疫，以相同的剂量加强免疫2次，均间隔2周。另一组用BCG(105CFU)皮内注射免疫1次。每组的10只鼠在最后一次加强免疫后，无菌取脾培养，上清供检测细胞因子用。另外10只小鼠则用结核菌H37Rv经静脉攻击，于2周后取脾、肝和肺进行培养结核菌并进行菌落计数。结果 pVS85BG免疫组的鼠脾淋巴细胞的培养上清中的mIL-2和mIFN-γ的平均含量分别为(339.9±59.4)pg/ml和(432.1±74.4)pg/ml，显著高于3个阴性对照组（P＜0.001），与BCG免疫组差异无显著性(P＞0.05)。5个组的平均mIL-6和mIL-10差异无显著性。pVS85BG免疫组小鼠的脾、肝和肺的平均结核菌菌落数分别为(32954.2±4457.5)CFU/g，(32748.0±3634.4)CFU/g和(31741.7±7293.7)CFU/g，分别低于pVAX1、pIL2S和PBS等3个阴性对照组的相应器官的结核菌载量（P＜0.001），同时也显著高于BCG免疫对照组。结论 构建的DNA疫苗pVS85BG能够刺激机体产生抗结核菌所需的Th1型免疫应答，免疫鼠抵抗H37Rv攻击的能力显著增强。
【关键词】 结核； DNA疫苗； 细胞因子； 免疫保护
Construction and protective efficacy of the TB DNA vaccine expressing of Mycobacterium tuberculosis Ag85B and glutathione S-transferase fusion protein
ZHU Zhong-yuan，LIU Jian-bing，WANG Hai-bo，et al.
Department of Laboratory Medicine of the Affiliated Xinhua Hospital of Hainan Medical College，Haikou 570311，China
【Abstract】 Objective To evaluate the ability to produce cytokines in vitro and the protective efficacy of the mice immunized by the TB DNA vaccine pVS85BG we constructed.Methods Plasmid pVS85BG expressing fusion protein of Mycobacterium tuberculosis Ag85B and glutathione S-transferase were constructed by inserting ag85b and gst into the vector pVAX1.20 female C57BL/6 in bred mice in 5 groups immunized with the 100μg pVS85BG，pIL2S，pVAX1，PBS and BCG(105 CFU) for 3 times with 2 weeks interval except BCG(only one injection without boost).Sera and supernatants of 10 mice in each group were determined for hIL-2，mIL-2，mIFN-γ，mIL-6 and mIL-10 by sandwich ELISA.The other 10 mice in each group were challenged by 106 CFUs M tuberculosis H37Rv and killed for culturing H37Rv from the spleens，lungs and livers.Results The average concentrations of mIL-2 and mIFN-γ in the supernatants from pVS85BG immunized mice were (339.9±59.4)pg/ml and (432.1±74.4)pg/ml，significantly higher than those from the pVAX1，pIL2S，and PBS injected controls (P＜0.001).No significantly difference has been observed for the mIL-6 and mIL-10 concentrations from the mice in all 5 groups.The average M tuberculosis loads in the spleens，livers and lungs in the pVS85BG immunized group were (32954.2±4457.5)CFU/g，(32748.0±3634.4)CFU/g and (31741.7±7293.7)CFU/g respectively.The average bacterial loads of the 3 organs in the pVS85BG immunized group were significantly lower than those of their counterparts in pVAX1，pIL2S and PBS injected groups，but they were significantly higher than those of their counterparts in the BCG immunized controls.Conclusion TB DNA vaccine pVS85BG we constructed can induce Th1 immune response which is necessary for prevention against TB，and it has the ability to enhance protective immunity to H37Rv challenge in the immunized mice.
【Key words】 Mycobacterium tuberculosis; TB DNA vaccine; cytokines; immune protection
有效控制结核病的流行，除了政府重视，加强健康教育，采取一般性的预防措施和即时发现并治愈痰涂阳性肺结核病人以外，有效预防结核病的疫苗的普遍接种是关键［1］。大量实践证明，BCG对控制原发结核、降低粟粒性结核和结核性脑膜炎的发病率是肯定的。近十几年，世界各地进行了8次BCG现场试验，结果是矛盾的。在欧洲、加拿大和美国部分地区进行的试验保护率较高，总发病率下降70%～80%。但在美国南方和南印度的结果相反，保护效果很差［2，3］。因此，寻求安全、稳定、效果更好的结核疫苗一直是结核病和疫苗专家工作的重点。本研究利用基因操作技术，将具有免疫保护作用的蛋白Ag85B(antigen 85B)和具有使表达合蛋白稳定的谷胱甘肽-S转移酶（glutathione S-transferase，GST）的基因连接，插入美国FDA推荐可用于人体的表达载体pVAX1中，构建表达结核菌保护抗原Ag85B与GST的融合蛋白的真核表达载体。提取并纯化该质粒后，免疫纯系近交系C57BL/6小鼠，免疫小鼠抵抗经静脉注射结核菌H37Rv攻击的能力显著增强。报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 结核菌H37Rv标准株（ATCC27294）
由武汉大学医学院免疫学系刘君炎教授赠送。其毒力通过定期小鼠体内传种维持。结核菌传种在改良罗氏(Lowenstein-Jensen Medium，L-J)培养基进行。
1.1.2 pVAX1真核表达载体
美国Invitrogen公司产品，由美国国立卫生研究院张颖研究员提供。其基因序列及多克隆位点见该公司网站资料（WWW.invitrogen.com）［4］。
1.1.3 Gex-2T载体
大连宝生物公司提供。
1.1.4 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）DH5α及JM109菌株
华南热带农业大学生物中心保存菌株。
1.1.5 Ex Taq DNA酶，LA Taq DNA多聚酶，10×PCR缓冲液，dNTPs，限制内切酶Xba I，Hind Ⅲ，Pme I，Not I，Nhe I等 均由大连宝生物公司提供。
1.1.6 PCR试剂等
PCR 产物回收试剂盒，DNA连接试剂盒，λ-Hind Ⅲ DNA Marker，DNA Marker DL2000等均为大连宝生物公司提供。
1.1.7 BCG
上海生物制品研究所生产。
1.1.8 C57BL/6小鼠
购自北京维通利华实验动物公司。均为雌性，购买时6～8周龄，初次免疫时8～10周龄。动物在实验期间，饲养在无特殊病原体条件。该公司提供的C57BL/6小鼠的核心种群来源于Charles River Laboratories（Wilmington，Mass，USA）。
1.1.9 hIL-2、鼠白细胞介素-2（murine interleukin-2，mIL-2）、鼠干扰素γ（murine Interferon γ，mIFN-γ）、鼠白细胞介素-6（mIL-6）和鼠白细胞介素-10（mIL-10）ELISA法定量测定试剂盒 法国Diaclone Research公司（1，bd A.Fleming，25000 BESANCON，France）产品。
1.1.10 胎牛血清（FCS）
为广州暨南大学生物技术研究所提供进口分装胎牛血清。
1.1.11 RPMI 1640培养基
Gibco公司产品。RPMI1640完全培养基的配制：临用前，10ml FCS与90ml RPMI培养液混合即可。
1.1.12 酶免疫读数仪
芬兰Labsystem公司生产的Wellscan MKⅡ型。
1.2 方法
1.2.1 结核菌基因组DNA的提取 见文献［5］。
1.2.2 表达载体的构建过程 见图1。
(1)根据实验需要设计合成下列引物。GST-P7：5′-AGT TCT AGA GCC GCC GCC ATG TCC CCT ATA CTA GGT TAT TG-3′(41Mer)。除下划线部分为Xba Ⅰ酶切位点外，其余部分均同GST-P5。GST-P8：5′-A GCT TTG TTT AAA CTA GTC AGT CAC GAT GCG GCC GCT-3′(37 Mer)。下划线部分为Pme Ⅰ酶切位点。Ag85B-P5：5′-TCA TAT AAG CTT AGC GGC CGC GCC GCC GCC ATG ACC GCG GGC GCG TTC TCC-3′（51Mer）。下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点。双下划线部分为Not I酶切位点。斜体部分为Kozak序列。添加有起始密码子ATG。Ag85B-P6：5′-GAT TCT AGA TCA GCC GGC GCC TAA CGA ACT CTG C-3′（34 Mer）。下划线部分为Xba Ⅰ酶切位点。斜体下划线部分为终止密码子。引物Ag85B-P5和Ag85B-P6分别为结核菌Ag85B基因［6，7］（Ag85B，也称MT85B，fibronectin binding secreting protein，Genbank Accession Number：X62398）的109-126位和958-978位碱基序列，扩增物长度约为900bp。表达产物为Ag85B成熟蛋白。Ag85B-F：5′-AAT GAT CTT GGC CGC CTA CC-3′(20 Mer)。为Ag85B基因516-535位DNA片段与Ag85B-F引物序列完全互补。为测序引物。(2)将TB-V7［8］质粒用Xba I和Hind III双酶切，使用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收目的p-IL2S-2。(3)以TB-V2［8］质粒为模板，Ag85B-P5/ Ag85B-P6为引物，使用PyrobestTM DNA Polymerase PCR扩增目的片段Ag85B DNA。(4)将PCR扩增片段Ag85B DNA用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收。将回收后的片段用Xba Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，使用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收Ag85B DNA 片段a。(5)使用 DNA Ligation Kit中的Solution Ⅰ，将Ag85B DNA片段a和p-IL2S-2 DNA在16℃水浴中进行连接，热转化至E.coli Competent Cells DH5α中，涂布平板，过夜培养菌体。(6)挑选阳性菌落。培养增殖细菌，提取质粒，质粒命名为TB-V7-2。(7)将TB-V7-2质粒使用Xba I和Hind Ⅲ进行双酶切鉴定。(8)将TB-V7质粒分别使用T7 Promoter/pcDNA3.1R引物进行测序。测序结果均与参考序列一致。(9)将TB-V7-2质粒用Xba Ⅰ和Pme Ⅰ双酶切，使用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收目的TB-V7-2 DNA。(10)以TB-V5［8］质粒为模板，GST-P7/GST-P8为引物，使用 PyrobestTM DNA Polymerase PCR扩增目的片段GST DNA。(11)将PCR扩增片段GST DNA用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收。将回收后的片段用Xba Ⅰ和Pme Ⅰ双酶切，使用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收GST DNA片段b。(12)使用DNA Ligation Kit中的SolutionⅠ，将GST DNA片段b和TB-V7-2 DNA在16℃水浴中进行连接，热转化至E.coli Competent Cells DH5α中，涂布平板，过夜培养菌体。(13)挑选阳性菌落。培养增殖细菌，提取质粒，命名为pVS85BG。(14)pVS85BG质粒使用Xba Ⅰ和Pme Ⅰ进行双酶切鉴定。(15) pVS85BG质粒分别使用Ag85B-F/pcDNA3.1R引物进行测序。
1.2.3 质粒DNA的提取及纯化 见文献［5，9］。
1.2.4 C57BL/6的免疫程序
共分pVS85BG免疫组、pVAX1注射组、pIL2S［8］注射组、PBS对照组及BCG对照组，共5组，每组20只，其中10只小鼠用于脾淋巴细胞体外产生细胞因子试验，余下的10只用于观察疫苗免疫小鼠抵抗H37Rv攻击的试验。免疫方法：将各种抗结核DNA疫苗浓缩制剂用pH 7.2的无热源0.1M PBS稀释至1000μg/ml，取0.1ml分四点注射入每只小鼠腿部肌肉内，pVS85BG免疫组、pVAX1注射组、pIL2S注射组、PBS对照组，分别在0、15和30天分别免疫或者注射1次，共3次。BCG按要求皮内注射免疫，每只小鼠105个CFU。只免疫1次。
1.2.5 小鼠脾淋巴细胞的培养及上清收集
免疫组小鼠和各对照组小鼠经挑除眼球收集血清后断颈处死，用75%酒精消毒皮毛，无菌操作取脾称重，去筋膜，研磨成匀浆，加适量不完全RPMI 1640，纱网过滤，计数淋巴细胞数目，用RPMI 1640完全培养基配制成106/ml，接种于24孔培养板，5%CO2环境37℃培养72h，收集培养液，离心取上清-20℃保存待检。
1.2.6 细胞因子的定量测定
以生物素-亲和素双抗体夹心法定量检测mIFN-γ为例。(1)将小鼠脾淋巴细胞培养上清、标准品（mIFN-γ：1000pg/ml倍比稀释至31.25pg/ml）、标准品稀释液（作空白对照用）和质控品复溶液各100μL加入微孔内，均作复孔。(2)将生物素标记的抗mIFN-γ抗体用稀释液1：27.5稀释，每孔加50μl，微型混合器混匀。(3)置37℃恒温箱1h后，甩干液体，每孔加300μl洗涤液浸洗1min，共洗涤3次。(4)将工作浓度的辣根过氧化物酶标记的亲和素100μl加入各孔（含空白孔），37℃放置30min。(5)同前洗涤后，每孔加入100μl TMB底物避光反应15min。(6）各孔加入100μl 2M H2SO4终止反应，立即用酶免疫读数仪测OD450。（7）标准曲线完成后，将各标本复孔OD的均数代入方程求得mIFN-γ的含量。hIL-2、mIL-2、mIL-6和mIL-10的测定的基本过程同mIFN-γ的测定。
1.2.7 H37Rv感染C57BL/6小鼠
根据文献［10，11］改进。简要步骤：将结核菌H37Rv株接种于L-J斜面37℃培养20天，挑取菌落，加少许生理盐水，用组织研磨器制成悬液，与麦氏比浊管进行比色，配制成2mg/ml，冻存于-20℃。取0.1ml接种L-J斜面，共接种3管，培养20～30天，计数CFU。根据CFU计数结果，用无热源及无菌生理盐水将H37Rv菌配制成107CFU/ml，每只小鼠尾静脉注射0.1ml（106个结核菌）感染小鼠。
1.2.8 感染鼠组织器官的结核菌培养及计数
小鼠感染结核菌后喂养15天后杀鼠，无菌取出肝、肺和脾，称重、制备成匀浆。分别取原液、1：10和1：100稀释液各0.1ml接种于L-J培养基斜面，每只鼠的每个器官的每种浓度各接种3管，37℃培养20～30天后，观察并计数L-J斜面培养基上的结核菌菌落数。计算公式如下。
S（CFU）=C×(O+V)/O×10×相应管的稀释倍数
C：3个L-J培养管出现的菌落数的均数。如果为原液接种的3管的均数，则稀释倍数为1；如果为1：10稀释管的均数，则稀释倍数为10；如果为1：100稀释管的均数，则稀释倍数为100。
10：接种量为0.1ml，相当于1/10g，为常数。乘以10为每g器官里的结核菌数。
O：为器官的重量（g）。
V：为加入生理盐水的体积。1ml=1g。
S：为每只鼠的结核菌个数，单位为CFU/g。
1.2.9 统计学方法
pVS85BG疫苗免疫组与各对照组的细胞因子和脏器结核菌落数比较采用单向方差分析。两两之间的均数比较采用q检验。分析工具为SPSS10.0系统。
2 结果
2.1 表达结核菌Ag85B与GST融合蛋白表达载体的构建及鉴定
该质粒转化后，经蓝白菌斑及卡那霉素抗性筛选，均出现阳性克隆。质粒的酶切鉴定，电泳结果表明，经相应酶切割后电泳分析的结果与设计插入的目的基因片段大小一致。见图2。
DNA测序分析的结果显示，在Ag85B和GST基因之间，加入了Xba I的酶切序列TCT AGA，因此，在连接部位表达了相应的Ser-Arg 2个aa。与设计相符合。对比文献中的序列［6，7］和我们测序分析的结果，Ag85B和GST基因序列与文献报道完全一致。
2.2 结核DNA疫苗的含量及纯度
提取的pVS85BG疫苗、pVAX1和pIL2S用紫外分光光度计测得的OD260/OD280的比值为1.787、1.842和1.754，表明纯度达到要求。3种质粒的浓度分别为1675.6、1.234和1.356μg/ml，免疫时均稀释至1000μg/ml使用。
2.3 免疫组及对照组小鼠的培养上清的细胞因子含量对比
pVS85BG免疫组的C57BL/6小鼠血清中的平均hIL-2与BCG免疫对照组、pIL2S、pVAX1和PBS等3个阴性对照组的平均hIL-2含量差异无显著性。其脾淋巴细胞培养上清的mIL-2和mIFN-γ的平均含量与BCG阳性对照组的平均浓度差异无显著性，而显著高于pIL2s、pVAX1和PBS等3个阴性对照组的平均浓度（P＜0.001）。培养上清中的mIL-6和mIL-10的平均浓度在5个组之间差异无显著性。见表1。表1 结核DNA疫苗免疫后脾细胞培养上清细胞因子含量对比 （略）注：*与pVS85BG及BCG免疫组比较，差异均有非常显著性（P＜0.001)。其余两组间比较，均差异无显著性2.4 免疫组和对照组小鼠的脾、肝和肺的结核菌落数对比 pVS85BG免疫C57BL/6小鼠的脾、肝和肺组织培养的菌落均数均显著低于阴性或者空白对照组的结核菌菌落数，而显著高于BCG免疫组的相应器官的细菌菌落数(P＜0.001)。各组小鼠的肝、肺和脾结核菌菌落均数资料未列出，其对数值见表2。表2 结核DNA疫苗及对照组免疫C57BL/6小鼠的内脏培养结核菌落数对数值比较 (略)
从表2中可以看出，结核DNA疫苗pVS85BG免疫的C57BL/6小鼠的脾、肝和肺淋巴细胞载量的对数值比阴性对照组（pIL2S、pVAX1和PBS）均下降0.3个对数单位（log10）。而BCG免疫对照组的相应器官的结核菌载量分别下降0.8、0.6和0.7 个log10对数单位。
各组动物的脾、肝和肺的结核菌生长情况见图3。
3 讨论
Wolff等首次报道注射编码β-半乳糖苷酶的裸露质粒DNA到肌细胞，导致基因转移到肌细胞，在核内转录，并合成该酶［12］。Tang等证实注射质粒可诱发免疫应答［13］。Silva等首先开始结核病DNA疫苗的研究［14］。他们用麻风分枝杆菌（M leprae）hsp65（heat shock protein）基因转染巨噬细胞系给同种小鼠免疫后，能保护这些小鼠抵抗静脉注射结核菌H37Rv或BCG感染。
Ag85复合群（Ag85 complex）中有Ag85A、Ag85B和Ag85C三个成员。 Huygen等用编码分泌型(含信号序列)或非分泌型(成熟型)Ag85A(30～32kDa霉醇基转移酶)的质粒载体免疫小鼠，在肌注编码分泌型Ag85A的质粒之后，小鼠显示出广泛的免疫应答迹象，如淋巴细胞增多、体液应答增强、IFN-γ和IL-2分泌，以及细胞毒性T细胞(CTL)比例上升等，并且可保护小鼠抵御临床分离的结核菌强毒株CSU37感染，而成熟型Ag85A DNA质粒的保护作用较弱，因此，分泌型Ag85A可作为结核病DNA疫苗的候选目的抗原［15］。Lozes和Montgomery证明，Ag85B质粒DNA在不同小鼠可产生不同的免疫效果，对C57BL／6小鼠具有与Ag85A类似的免疫效果，而对BALB/c小鼠却无效［16，17］。
表达Ag85B或MPT64的疫苗与表达GM-CSF的载体联合免疫可以增强T细胞免疫近2倍，但对处于感染期的保护作用增加不明显［18］。Briton等报告表达IL-2及表达Ag85B或MPT64的DNA疫苗联合免疫可增加淋巴细胞数量，CD4+和CD8+细胞分泌IFN-γ，但增强保护力的作用属中等［19］。
不同DNA载体表达的亚单位疫苗单独免疫时效果不很好，联合免疫时可以产生更好的保护效果，如降低CFU计数，感染后的生存延长等［19］。具有高免疫力的质粒简单的混合可能会引起抗原竞争。但构建表达杂交基因可解决上述问题。生产表达多种蛋白的基因疫苗从经济学角度讲也是实惠的。Corixa公司的Reed研发的Mtb72F DNA疫苗（表达结核菌Mtb39和32kDa丝氨酸蛋白酶）产生了令人信服的结果。另一种表达40 kDa磷酸盐转运蛋白（PstS-3）和分枝菌酸转移酶Ag85A也被证明可增强免疫性和保护效果。
由于DNA疫苗初始免疫即能诱导应答，因此其在初免—加强免疫策略方面前景广阔。Ag85抗原复免，其脾细胞产生IL-2及IFN-γ的量可增加2～4倍。蛋白抗原加强免疫增强结核菌静脉感染的保护力，揭示了MHCⅡ限制性Th1型CD4+辅助性T细胞在介导免疫保护方面的重要作用。重组的水痘病毒也被用作加强免疫，但发挥作用的是MHCⅠ类CD8+ T细胞。痘病毒应用广泛，在人类使用证明是非常安全的。与表达单个抗原的DNA疫苗相比，重组病毒或细菌疫苗的缺点是不能有很好的加强免疫效果。表达Ag85A的重组修饰的安卡拉豆苗病毒（recombinant modified vaccinia Ankara，MVA）抵抗结核菌免疫的效果与BCG相当。尽管结果十分诱人，但对实验的结果必须谨慎，因为这些结论是在免疫后不久进行的实验得出的。
本研究在总结以前一些学者对于构建的表达结核菌Ag85B的DNA疫苗具备较好的刺激机体产生细胞免疫应答的能力，而且一致公认该抗原具有免疫保护作用的基础上，构建与GST的融合蛋白，主要目的是利用融合蛋白的分子变大，结果稳定，有利于抗原刺激机体免疫系统的原理，构建免疫效果优于单蛋白免疫效果的DNA疫苗。
构建的DNA疫苗pVS85BG及表达hIL-2信号肽的质粒pIL2S经过菌斑筛选，抗生素抗性筛选、限制性内切酶鉴定及基因测序证明，构建的DNA疫苗及pIL2S质粒的基因序列与文献报道的一致，符合设计要求（图1和图2）。
pVS85BG免疫小鼠后，其脾淋巴细胞培养上清的平均mIL-2、mIFN-γ分别为(339.9±59.4)pg/ml和(432.1±74.4)pg/ml，显著高于pVAX1、pIL2S和PBS对照组（P＜0.001），与BCG免疫对照组差异均无显著性。实验组和对照组脾淋巴细胞培养上清的平均mIL-6和mIL-10浓度，每组之间差异均无显著性（P＞0.05，见表1）。表明我们构建的DNA疫苗pVS85BG可刺激机体产生Th1型免疫应答。
pVS85BG免疫C57BL/6小鼠组的脾、肝及肺的平均结核菌量分别为(32954.2±4457.5)CFU/g，(32748.0±3634.4)CFU/g和(31741.7±7293.7)CFU/g，分别低于pVAX1、pIL2S和PBS等阴性对照组的相应器官的结核菌载量，差异有显著性（P＜0.001，见表2）。与BCG免疫小鼠的结核菌量比较，3个器官的平均细菌量的差异仍有显著性。揭示本研究中构建的DNA疫苗pVS85BGG免疫的小鼠具有抵抗标准结核菌株H37Rv经静脉攻击的能力，免疫保护作用显著。
表2同时也显示pVS85BG的免疫保护作用与BCG的免疫保护作用差异还是有显著性（表2及表3）。从免疫程序分析，DNA疫苗需免疫3次，而BCG只需免疫1次。尽管DNA疫苗和BCG均可在哺乳动物体内复制，但是DNA疫苗表达的只是单个的抗原，而BCG的菌体抗原和分泌抗原种类和表达量较DNA疫苗要多得多，这可能是目前研制出的结核DNA疫苗无法与BCG的免疫效果相当或是更优的原因。
本研究的结果表明，pVS85BG具有刺激机体产生的抗结核菌免疫所需的Th1型免疫应答的能力。小鼠经该疫苗免疫后，抵抗结核菌H37Rv攻击的能力比对照组显著增强。尽管此疫苗的免疫保护效果与BCG比较尚有差距，但对其进行联合免疫等方面进行深入研究是必要并且具有潜力的。(本文图片见封三)
【参考文献】
1 刘宇红，姜广路，赵立平，等.第四次全国结核病流行病学抽样调查-结核分枝杆菌耐药性分析与评价.中华结核和呼吸杂志，2002，25：224-227.
2 Bloom B R，C J L Murray.Tuberculosis：commentary on a reemergent killer.Science，1992，257：1055-1064.
3 Colditz G A，Brewer T F，Berkley C S，et al.Efficacy of BCG vaccine in the prevention of tuberculosis.Meta analysis of the published literature.JAMA，1994，271：698-702.
4 FDA，Points to consider on Plasmid DNA Vaccines Preventive Infectious Disease Indications，Published December 22，1996，Docket no.96N-0400.
5 朱中元，王海波，谢勇，等.结核分支杆菌inhA基因突变的测序研究.中华结核和呼吸杂志，2001，24：48-51.
6 De Wit L，Palou M，Content J.Nucleotide sequence of the 85B-protein gene of Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium tuberculosis.DNA Seq，1994，4：267-270.
7 Matsuo K，Yamaguchi R，Yamazaki A，et al.Cloning and expression of the Mycobacterium bovis BCG gene for extracellular alpha antigen.J Bacteriol，1988，170：3847-3854.
8 朱中元.抗结核分枝杆菌DNA疫苗的构建、体外免疫功能评价及保护效果实验研究.华南热带农业大学博士论文，2004，5.
9 萨姆布鲁克J，D W拉塞尔，著.黄培堂等译.分子克隆实验指南(第三版).北京：科学出版社，2003，23-59.
10 Chackerian A A，Perera TV，Behar S M.Gamma Interferon-producing CD4+ T lymphocytes in the lung correlate with resistance to infection with Mycobacterium tuberculosis.Infect Immun，2001，69：2666-2674.
11 Kamath A T，Feng C G，Macdonald M，et al.Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis.Infect Immun，1999，67：1704-1707.
12 Wolff J A，Malone R W，Williams P，et al.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.Science，1990，247：1465-1468.
13 Tang D，Devit M，Johnston S A.Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response.Nature，1992，356：152-154.
14 Silva C L. A single mycobacterial protein (hsp65) expressed by a transgenic antigen-presenting cell vaccinates mice against tuberculosis.Immunol，1994，82：244-248.
15 Huygen K，Content J，Denis O，et al.Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine.Nat.Med，1996，2：893-898.
16 Lozes E.Immunogenicity and efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding the components of the secreted antigen 85 complex.Vaccine，1997，15：830-833.
17 Montgomery D L，Huygen K，Yawman A M，et al.Induction of humoral and cellular immune responses by vaccination with M-tuberculosis antigen 85 DNA.Cell Mol Biol，1997，43：285-292.
18 Kamath A T，Hanke T，Briscoe H，et al.Co-immunization with DNA vaccines expressing granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and mycobacterial proteins enhances T-cell immunity，but not protective efficacy against M.tuberculosis.Immunology，1999，96：511-516.
19 Palendira U，Kamath A T，Feng C G，et al.Coexpression of interleukin-12 chains by a self-splicing vector increases the protective cellular immune response of with DNA vaccines expressing granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and mycobacterial proteins enhances T-cell immunity，but not protective efficacy against M tuberculosis.Immunology，2002，99：511-516.
基金项目：海南省自然科学基金资助项目（编号：30221）
作者单位：1 570311 海南海口，海南医学院附属新华医院
2 571101 海南海口，华南热带农业大学国家生物技术重点实验室
(编辑：李令)