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家兔肝抑素对大鼠肝癌的作用

来源:中华医学研究杂志
摘要:【摘要】目的研究肝抑素(HC)对大鼠实验性肝癌的治疗作用和作用环节。方法采用二乙基亚硝胺(DEN)诱导法建立大鼠肝癌模型。观察大鼠肝脏的病理改变、肝表面癌结节数、肝重/体重。采用流式细胞仪检测肿瘤细胞的动力学变化。...

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  【摘要】  目的  研究肝抑素(HC)对大鼠实验性肝癌的治疗作用和作用环节。方法  采用二乙基亚硝胺(DEN)诱导法建立大鼠肝癌模型。观察大鼠肝脏的病理改变、肝表面癌结节数、肝重/体重。以甲胎蛋白(AFP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)和碱性磷酸酶(ALP)作为观察指标。采用流式细胞仪检测肿瘤细胞的动力学变化。结果  大剂量HC的疗效优于阿霉素(ADM),其作用环节是阻滞了G0~G1期细胞的增殖;中等剂量HC的疗效与ADM相似,但其作用环节则是阻滞了G2~M期细胞的增殖。结论  本研究证实了HC在体内应用能抑制肝癌细胞的增殖,延缓肝癌的发生发展。

  【关键词】  肝抑素;  大鼠;  肝肿瘤;  二乙基亚硝胺

  【Abstract】  Objective  To study the therapeutic effect and protective effect of experimental hepatocellular carcinoma in rats with rabbit hepatic chalone(HC).Methods  Hepatoma rats were induced by diethylnitrosamine(DEN).The changes of hepatoma nodules and ratio of liver/body weight were recorded and the alpha fetoprotein(AFP),γ-glutamyl transferase(γ-GT) and alkaline phosphatase(ALP) and the pathological changes of livers were observed.The cellular dynamic parameters were studied by flow cytometry.Results  HC of high dose group was better than adriamycin(ADM) group,the protective effect might be to postpone advancement of G0-G1 phase cells.HC of appropriate dose group was the same as ADM group,and the protective effect might be to postpone advancement of G2-M phase cells.Conclusion  The HC in this study could inhibit the prolifiration of hepatoma cells and delay the forming of hepatoma.

  【Key words】  hepatic chalone;rat;hepatocellular carcinoma;diethylnitrosamine

  肝抑素(hepatic chalone,HC)是由生物正常肝细胞通过自分泌和旁分泌作用产生的、能抑制肝细胞增殖的一种分子量为13500的多肽蛋白质,它在肝脏的再生调节机制中发挥着重要的作用。有研究[1]发现HC对人肝癌细胞(SMMC-7721细胞株)在体外的增殖有明显的抑制作用,抑制率为77.7%,而对人胃癌细胞(BGC-823细胞株)的增殖则无抑制作用,提示HC是抑制肝癌细胞增殖的特异性因子。至于HC在体内应用是否可以抑制肝癌细胞的增殖,至今未见有文献报道,因此很有必要对HC进行深入的探讨和研究。本研究建立由二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)诱发的大鼠肝癌模型,采用病理学、血清生化指标和细胞动力学的方法,研究HC对大鼠体内肝癌的治疗作用和作用环节。

  1  材料与方法

  1.1  动物分组  选取健康雄性SD大鼠(由广东医学院实验动物中心提供)60只,体重100~120g,随机分为6组(每组10只):正常组、模型组、阿霉素(adriamycin,ADM, 由浙江海正药业股份有限公司生产)组和HC(本实验室提纯[2])治疗组:A组,大剂量;B组,中等剂量;C组,小剂量。
  
  除正常组外,其余5组大鼠在饮水中均加入0.01%DEN(Sigma公司产品),喂养90天,停止喂养DEN,然后开始治疗。

  1.2  治疗方法  正常组和模型组每天1次腹腔注射生理盐水0.5ml/只,而ADM组每天1次腹腔注射ADM 3mg/kg,A组每天1次腹腔注射HC 9mg/kg,B组每天1次腹腔注射HC 3mg/kg,C组每天1次腹腔注射HC 1mg/kg。给药处理30天。
  
  ADM剂量的选择以临床化疗剂量30mg/m2为依据,按人与大鼠间体表面积折算的等效剂量比值表计算得出。取折算得出的ADM剂量为HC的中等剂量(3mg/kg),并由此得出HC的大剂量(9mg/kg)和小剂量(1mg/kg)。

  1.3  常规检查  称体重,解剖大鼠,取出肝脏,称肝重,计算肝重比体重,记录肝表面癌结节数。

  1.4  生化检测  断头取血,收集血清,用放射免疫测定法检测血清甲胎蛋白(AFP)的分泌量,用7170A型自动生化分析仪(由日本岛津公司制造)测γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、碱性磷酸酶(ALP)的含量。

  1.5  病理检查  统一取右叶肝组织,福尔马林液固定,石蜡包埋,制备成2μm厚的切片,HE染色,光镜下观察肝组织的病理变化。

  1.6  流式细胞仪检测  取3块肝组织(每块约为1g),制备离散肝细胞悬液,以碘化丙啶荧光素染色显示核DNA,用流式细胞仪(美国BD公司产品,FACS Vantage)对样品进行DNA含量分析,得出各细胞周期的分布比率。

  1.7  统计学方法  各组数据用x±s表示,组间比较采用t检验加方差分析。

  2  结果

  2.1  各组大鼠的生存率  实验结束时,各组大鼠的死亡数和生存率见表1。

  表1  大鼠死亡数和生存率 (略)

  模型组5只大鼠的死亡原因均为腹腔内出血;ADM组3只大鼠的死亡原因也为腹腔内出血; A组2只大鼠的死亡原因同样为腹腔内出血;B组1只大鼠死于恶病质,3只死于腹腔内出血;C组4只大鼠的死亡原因也是腹腔内出血。

  2.2  HC对大鼠肝癌病理改变的影响  尸检发现,正常组肝脏外观正常,无一例出现自发性肝癌,而模型组大鼠的肝脏明显增大,各叶散在大小不等的灰白结节,少数成巨块状。光镜下呈典型的柱状及腺管样癌巢结构,且癌巢周围肝细胞异型性明显,伴癌细胞浸润。ADM组、A组、B组与C组大鼠也均有癌结节存在,但肝表面癌结节数明显低于模型组(见表2),经统计学分析,ADM组、A组、B组与模型组的差异有显著性(P<0.05)。而与ADM组相比,A、B、C三组中A组的差异有显著性(P<0.05)。
  
  在4个治疗组的病理切片中,A组有5例优于其余各组,切片显示:细胞排列有序,细胞核大小一致,核浆比例基本正常,病理有丝分裂少见,癌巢周围肝细胞异型性不明显,无癌细胞浸润。B组与ADM组相似,各有2例优于模型组,表现为:细胞排列紊乱,胞浆嗜碱性,核分裂相增多,可见多核和巨核细胞,但癌巢数明显少于模型组,且癌巢周围肝细胞异型性不明显,有少量癌细胞浸润。C组病理切片则与模型组接近。

  2.3  HC对大鼠体重、肝重、肝重比体重的影响  与正常组相比,模型组大鼠的体重均明显低于正常组大鼠(P<0.05),肝脏重量和肝重比体重均明显高于正常组(P<0.05)。与模型组相比,ADM组、A组、B组和C组大鼠的体重均明显高于模型组(P<0.05),肝脏重量和肝重比体重明显低于模型组(P<0.05)。与ADM组相比,A组和B组大鼠的体重高于ADM组,肝脏重量和肝重比体重低于ADM组,但经统计学分析只有A组的差异有显著性(P<0.05)(见表2)。

  2.4  HC对大鼠血清中AFP、γ-GT、ALP的影响  与正常组相比,模型组大鼠的AFP、γ-GT、ALP水平均明显高于正常组(P<0.05)。与模型组比较,ADM组、A组和B组大鼠的AFP、γ-GT、ALP水平均明显低于ADM组(P<0.05)。与ADM组相比,A组大鼠的AFP、γ-GT、ALP水平均明显低于ADM组(P<0.05)(见表3)。

  2.5  流式细胞仪检测结果  与模型组相比,第120天时,A组G0-G1期细胞百分率显著上升(P<0.05);ADM组、A组、B组和C组S期细胞百分率显著下降(P<0.05);B组和C组G2-M期细胞百分率显著上升(P<0.05)(见表4)。

  表2  ADM和HC对大鼠肝癌结节、体重、肝重、肝/体重比的影响  (略)

  注:※P<0.05,vs正常组;△P<0.05,vs模型组;□P<0.05,vs ADM组

  表3  ADM和HC对大鼠血清中AFP、γ-GT、ALP的影响  (略)

  注:※P<0.05,vs正常组;△P<0.05,vs模型组;□P<0.05,vs ADM组

  3  讨论
  
  DEN为强烈的化学诱癌剂,其所诱发的大鼠肝癌为肝细胞癌,与人肝癌的发生过程相似。本实验采用小剂量长期饮水法[3]诱发肝癌70天,再用ADM或HC腹腔注射,到实验进行到120天时,处死大鼠。巨检和组织切片显微观察发现,模型组大鼠肝癌发生率为100%,证明本次实验中大鼠肝癌模型诱发成功。

  表4  ADM和HC对大鼠不同细胞周期的肝细胞比例的影响  (略)

  注:△P<0.05,vs模型组

  肝细胞癌变可能是由于在细胞分裂过程中致癌物引起细胞特异基因的改变,如肝细胞特异基因被封闭,以致与之相互联系而又相互阻遏的分裂基因封闭,从而引起增生代谢与特异代谢关键酶活性不可逆的改变,使之失去正常肝细胞增殖与特异功能的平衡,而代之以不受控制的增生,最后形成癌细胞[4]。而目前肝癌的疗效远不理想的主要因素之一就是能做手术切除的早期肝癌不足1/5[5]。因此,从预防和治疗的角度来看,抑制癌前细胞的增生或促进癌细胞的分化都有重要意义[4]。
  
  AFP是一种胚胎性蛋白,主要由胚肝产生,在肝癌中分泌量增高,因此,AFP被认为是诊断肝癌的标志蛋白。γ-GT在鼠肝中活性很低,而在诱癌过程中活性逐渐上升,故γ-GT被认为是肝癌变过程中早期癌前病变的生化标志。AFP和γ-GT已被作为维甲酸诱导人肝癌细胞分化的观察指标[6]。Fanjul等[7]研究认为,ALP可作为肝癌细胞的分化标志。因此,本研究用AFP、γ-GT和ALP作为观察肝癌细胞恶性表型逆转的指标。结果表明,在诱癌过程中AFP、γ-GT和ALP有一致性的变化,三者均明显升高,三者联合能更好地观察肝癌细胞的分化。
  
  在实验中我们发现,模型组大鼠不仅全部发生肝癌,而且肝重/体重及AFP、γ-GT、ALP等指标均明显高于正常组。但是,用不同剂量HC腹腔注射后,三种剂量HC治疗组大鼠的体重明显高于模型组,肝重/体重明显低于模型组。其中大剂量和中等剂量的HC治疗组大鼠的肝表面癌结节数和血清AFP、γ-GT、ALP等指标均明显低于模型组。说明这两种剂量的HC不仅能抑制肿瘤细胞的增长,还能促进肿瘤细胞分化。
  
  ADM自20世纪70年代开始临床应用以来,是实体瘤治疗最有效的药物之一。在本研究中,各项指标均表明ADM对大鼠肝癌有着明显的抑制作用,而和三种剂量的HC治疗组相比,大剂量HC治疗组大鼠的肝重、肝重/体重和血清AFP、γ-GT、ALP等指标均明显低于ADM组,而中等剂量HC治疗组大鼠的各项指标则与ADM组无明显差别。提示大剂量HC的疗效优于ADM,中等剂量HC的疗效则与ADM相似。
  
  细胞周期和肿瘤的关系密切。不同周期时相的细胞对外界各种因素包括药物和射线等敏感性不同,是化疗和放疗等抗癌的理论依据[8]。实验结果表明,HC作用于肝癌细胞可引起细胞周期的改变,突出的特点是中小剂量HC治疗组出现G2~M期阻滞现象,而大剂量HC治疗组则出现G0~G1期停滞现象。其原因可能是:(1)HC在高浓度下显著抑制细胞DNA合成,造成细胞从G1期向S期的发展受阻,G0~G1期细胞堆积或停滞;(2)恶性肿瘤细胞群体中,处于增殖周期的瘤细胞,即S期和G2~M期细胞,其分裂增殖能力很强,但同时对理化药物的反应也最敏感,或被直接杀伤,表现为形态学死亡,或增殖活性受抑制[9]。我们推测,不同剂量的HC对肝癌细胞周期产生不同的影响,周期阻滞后的结果可能也各不相同。我们还发现,HC作用下S期细胞明显减少。S期为DNA合成期,遗传物质倍增主要发生在此期。中小剂量HC治疗组S期细胞下降率虽不及大剂量HC治疗组显著,但与模型组相比其下降率也十分明显,说明这两组相对低剂量的HC同样可显著抑制肝癌细胞DNA的合成,只是作用强度不如大剂量的HC。
  
  本实验以DEN诱发大鼠肝癌作为模型,以HC作为干预因素,发现大剂量和中等剂量HC对成癌过程有显著的阻滞作用,而且HC使用起来具有针对性强、疗效显著、无明显的毒副作用等优点,有减轻症状,延长生存期的作用,所以,HC是一种特异的抑制肝癌细胞增殖的生化药物,有很好的临床应用前景,值得进一步研究。

  【参考文献】

  1  孙亚平,成令忠,刘银坤,等.大鼠肝抑素纯化及其对再生肝细胞和肝癌细胞增殖的影响.上海医科大学学报,1997,24 (1):7.

  2  陈博,朱健平,唐浩,等.家兔肝抑素的提纯和鉴定.中国药业,2004,13(8):44.

  3  陈树军,张玉砚,许凯黎,等.二乙基亚硝胺诱导大鼠肝癌过程中血清甲胎蛋白分子变异体动态变化.肿瘤,1989,(1): 17.

  4  罗明,贺平,吴孟超,等.苦参碱和氧化苦参碱对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌的预防阻断作用.肿瘤预防杂志,2000,7 (6):561.

  5  吴孟超.肝胆外科的回顾现状及展望.中国实用外科杂志,2000,20(1):5.

  6  艾兆伟,查锡良,刘毅,等.视黄酸对人肝癌细胞浆中某些表型的逆转作用.生物化学与生物物理学报,1990,(2):135.

  7  Fanjul M,Theveniau M,Palecoby C,et al.Expression and characterization of alkaline phosphatase during diff erentiation of human pancreatic cancer (Capan-1) cells in culture.Biol Cell,1991,7(3):15.

  8  Seiter K,Feldman EJ,Tranganos F,et al.Phase 1 study on Taxol in acute leukemias: Evaluation of in vivo induction of apoptosis by Taxol. Leukemia,1995,9: 1961.

  9  Kerr JFR,Winterford CM,Harmon V. Apoptosis:Its significance in cancer and cancer therapy.Cancer,1994, 73:2013.

  作者单位:1 524023 广东湛江,广东医学院生理科学实验室

       2 524023 广东湛江,广东医学院第一临床学院2002级

  (编辑:守  中)

作者: 陈博郑颖 2006-8-19
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