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【摘要】 目的 依据T细胞的发育机制理论，诱导针对移植物特抗原的异性免疫耐受。方法 先用致死剂量的γ射线，将受者的T细胞及干细胞去除，形成了一个不具干细胞、前T细胞和T细胞的受者模型，称受者模型Ⅰ。同时经同种皮肤移植制造正常的受者对供者器官的免疫排斥反应的模型，称模型Ⅱ。从模型Ⅱ中经免疫磁珠分选取得被供者抗原所激活的、具有抗原提呈功能的树突状细胞，与正常的事先准备好的受者骨髓细胞在体外混合后回输至受者模型Ⅰ中。受者Ⅰ完成免疫造血功能重建后，再对其行同种皮肤移植。分5组，分别观察移植皮片的存活时间，并常规病理组织切片和流式细胞分析检测。结果 由T细胞发育的上游诱导产生特异性的免疫移植耐受，比较对照组，实验组皮片存活时间显著延长（P＜0.005），流式细胞分析和病理组织学分析差异也有显著性。结论 在所建立的模型和系统中，能诱导移植物特异性的免疫耐受，也进一步验证了胸腺的阴性选择理论。
【关键词】 树突状细胞； 移植； 耐受； 胸腺； T细胞发育
Induction of transplantation tolerance with allograft-activated host dendritic cells
XU Qi-qi，LI Mei，WANG Song-xia,et al.Department of Immunology，Peking University Health Science Center，Beijing 100083,China
【Abstract】 Objective The negative thymic selection is critical for the maturation of bone marrow derived cells to T cells.Negative selection occurs in thymic medulla and is normally mediated by bone marrow derived APC，like dendritic cells (DC) or macrophages.Immunodominant allopeptide-pulsed host dendritic cells can successfully induce transplantation tolerance.Methods Host dendritic cells were activated by allo-skin transplantation on day -10 to present the donor-specific antigens.Murine recipients of allogeneic skin grafts on day 0 were given transfusion of these activated dendritic cells and isogeneic bone marrow cells after lethal irradiation.Results Transfusion of donor-antigen-specific activated host dendritic cells plus isogeneic bone marrow cells led to prolonged skin allograft survival in recipients treated with lethal irradiation.In contrast，bone marrow cells transfusion alone failed to induce donor-specific tolerance.Conclusion In the absence of chronic immunosuppression，transfusion of donor antigens activated dendritic cells can prolong skin allograft survival markedly.
【Key words】 T cell development;dendritic cells;transplantation;tolerance;thymus
器官移植在人造组织、器官成功应用之前仍然是挽救某些不可逆病变的最优的治疗手段。而造成移植手段失败的主要原因是由于移植后的排斥反应造成［1］。发展更为精细的组织配型以及大量新的免疫抑制药物的开发与应用是目前国内外对付排斥反应的手段。但是，移植供体的局限性必将导致HLA配型的局限性；而免疫抑制剂的毒性和副作用又限制了其长期和大量的应用［2，3］。因此，如何克服免疫排斥反应目前仍然是国内外外科学家和医生急于探讨和急需解决的课题。诱导移植受体对供体器官产生特异性免疫耐受可以避免长期应用免疫抑制药物所引起的非特异性免疫抑制及其他毒副作用，被认为是防止器官移植排斥的理想方法［4～6］。
Ｔ细胞，是介导细胞和体液免疫反应的核心细胞，也是排斥反应中的核心细胞。如果能使Ｔ细胞对于移植供体产生免疫耐受，将成为解决排斥反应的有效方法。但是，由于外周ＴＣＲ库的丰富内涵，以及供体组织器官的抗原多样性，使得诱发外周Ｔ细胞对于移植产生耐受的方案具有相当的难度，至今在国内外的解决办法也就是应用一些T细胞的抑制剂。为此，我们设计新的技术路线，要寻求出一种方法，既能诱导出T细胞对供体组织器官的耐受，而又能保持T细胞的正常免疫功能，以期待得到解决此问题的理想方案。众所周知，外周不同的Ｔ细胞和TCR都是源于相同的骨髓来源的前T细胞，其多样性是在胸腺发育过程中通过TCR基因重排而产生的，而其自身免疫耐受主要是产生于T细胞在胸腺发育过程中的阴性选择，通过阴性选择，克隆清除自身反应性T淋巴细胞，这是中枢耐受的主要机制之一［7，8］；最新的研究还发现，非删除性的耐受在中枢耐受中也有着极其重要的作用，主要包括CD4+、CD8+调节性T细胞Treg的作用［5，6］；S.F.Oluwole等［9，10］发现通过胸腺内给与提呈供者MHC多肽的激活的DCs能诱导移植物特异性免疫耐受，同时，通过外周静脉途径，也能诱导类似的耐受，进一步研究表明其耐受形成机制可能是由于体内同种MHC激活的同种反应性T细胞回流入胸腺所致，这些抗原特异性激活的反应性T细胞能从血流进入胸腺，对于维持获得性的免疫耐受至关重要。如果能够从T细胞发育的上游部位，造成T细胞发育的选择，即选择对移植物的耐受，将可能成为克服排斥，成就无毒无害之免疫耐受的有效方案。
1 材料与方法
1.1 动物 雌性BALB/c（H2d，受者）、雄性C57BL/6（H2b，供者）和雄性129（H2k，特异性对照供者）鼠，由北京大学医学部动物中心提供，均为6～８周龄，全部的动物都饲养于北京大学医学部实验动物部SPF-II级动物房。
1.2 试剂硫酸新霉素和小鼠淋巴细胞分层液HISTOPAQUE○R-1083购自Sigma-Aldrich，Inc公司。Dynabeads○R小鼠pan T (Thy 1.2)磁珠标记的抗体购自Dynal，Inc.公司。PE标记抗小鼠CD4抗体，FITC标记抗小鼠CD8抗体由北京大学医学部免疫学系提供。DMEM和PBS由北京大学人民医院提供。
1.3 激活并分选宿主树突状细胞 为激活宿主树突状细胞（DCs），在分选细胞前的第１０天，给BALB/c宿主动物行同种异体皮肤移植，皮片供者为C57BL/6鼠。然后于收获细胞的当天处死这些BALB/c宿主动物，取它们的脾脏，通过HISTOPAQUE○R-1083小鼠淋巴细胞分层液离心分层收获单核细胞，再使用Dynabeads○R小鼠pan T (Thy 1.2)磁珠抗体通过阴性分选去除小鼠Thy 1.2阳性的细胞，最终得到含激活DCs的小鼠脾细胞，用DMEM调整细胞浓度到3.0×107 cells/ml。
1.4 宿主骨髓细胞分选 用１ｍｌ注射器使用DMEM冲洗BALB/c宿主动物的股骨和胫骨骨髓腔，收集细胞，离心洗涤一遍，然后用DMEM调整细胞浓度到5.0×106 cells/ml。
1.5 受者动物的准备 在接受皮肤移植前的第３０天，BALB/c受者首先接受900rad致死量的伽玛射线照射，射线源为北京大学医学部钴-60照射室，然后于照射后的６h内，每只BALB/c受者，通过尾静脉，或者输入1.0×106骨髓细胞，或者输入1.0×106骨髓细胞和5.0×106激活的宿主DCs细胞的混合细胞。
1.6 移植和耐受诱导 在回输细胞后的第３０天，不同处理的BALB/c受者给予同种异体皮片移植，取自小鼠尾巴的皮肤剪裁成大小为0.9cm×0.9cm的皮片［11］，如表１所示，接受来自C57BL/6鼠的皮片的动物作为耐受诱导组１，接受来自129鼠的皮片的动物作为特异性对照组３。
1.7 病理组织学分析 于空白对照组排斥的时间，即皮片移植后第１１天取材，取材部位是移植皮片及其周边０．５ｃｍ范围内的皮肤组织，在北京大学干细胞中心处做石蜡切片，HE染色，光镜分析。
1.8 流式细胞分析 分别于皮片移植术后第１１、１９、２３天取移植受者外周血，溶解红细胞后，使用ＰＥ标记抗小鼠CD4抗体和ＦＩＴＣ标记抗小鼠CD8抗体，双标直染；然后使用FACScan (Becton Dickinson)行流式细胞分析外周血CD4+或者CD8+T细胞以及两者的比例。
1.9 统计学分析 采用SAS软件，使用配对ｔ检验来比较各组间皮片存活时间差异，P＜0.05认为差异有显著性。
2 结果
2.1 致死量照射后宿主动物的免疫造血功能重建 实验组受者动物（BALB/c鼠）在移植前30天，首先给予致死量伽玛射线（900rad）照射，同时在6h内通过尾静脉混合回输激活的DCs（去除T细胞的脾细胞）和同基因骨髓细胞，或者仅回输同基因骨髓细胞；随后受者动物将开始免疫造血功能重建。30天后进行小鼠尾部皮片移植（供者分别为C57鼠和特异性对照129鼠）。在照射后的3个月的观察期间，各组动物均存活良好。
2.2 接受回输激活的DCs的移植模型中，皮片存活时间延长 如表1所示，不同分组间，皮片存活时间存在明显差异。其中，组0为受者未接受任何特殊处理，直接行皮片移植的结果，其皮片中数存活时间（MST）为11天；组1为受者经致死量伽玛射线照射后给予激活的DCs和同基因骨髓细胞经免疫造血功能重建30天后，行皮片移植的结果，MST=20天；两者相比，组1受者皮片存活时间明显延长，统计学分析为差异有显著性（P＜0.005）。图1为第11天组0（左）和组1（右）的移植皮片的照片，组0受者的移植皮片完全被排斥脱落，而组1的皮片存活良好；图2为组1受者移植皮片第15(A)，17(B)，19(C)，21(D)，23(E)天的照片，可见第21天前皮片均生长良好，第23天时皮片颜色加深，出现边缘结痂，排斥的迹象 表1 受者动物给予不同处理后行同种皮片移植、皮片存活时间统计表注：受者鼠在皮片移植前３０天给予900rad致死量伽玛射线照射，同时如表1所示，于照射后６h内回输不同的细胞。表中ＭＳＴ的计算基于３次不同的实验结果；*P＜0.005组１和组０间；P＜0.0001组１和组３间。MST，Median Survival Time，即中数存活时间。DC，指经同种移植激活的树突状细胞，即BALB/c小鼠先接受同种皮片移植（供者为C57鼠），10天后取脾细胞，经淋巴细胞分层液分层离心得到单核细胞，并用磁珠标记的抗小鼠pan-T抗体阴性分选去除Ｔ细胞后得到的细胞。BMC，为同品系的BALB/c小鼠骨髓细胞
2.3 激活的DC细胞诱导供者特异性移植耐受 为证实激活的DC细胞诱导的是供者特异性的耐受，我们取无关的供者129鼠的尾部皮片，如表1组3所示，与组1相比，受者的处理完全相同，但皮片来自无关的129鼠，该移植皮片在第10天均被完全排斥，MST=10天，与组1相比，差异有显著性（P＜0.001）。
相反，供者照射后仅给予骨髓细胞，产生的耐受是非特异性的，如组2、组4所示，受者对C57鼠和129鼠的皮片均产生耐受，两者MST均达到28天，差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.4 移植皮片部位病理组织学分析 如图3所示，第11天，组0(A)，组3（C）受者皮片完全被排斥，镜下观察见大量炎症细胞浸润，组0(A)皮片和受者移植部位相分离；相反，此时组1(B)皮片生长良好，镜下见移植皮片和受者移植部位没有脱离倾向，也未见明显炎症细胞浸润。
2.5 实验组的免疫学功能状态的流式细胞分析结果 分别于皮片移植术后第11、19、23天，取组0、组1移植受者外周血，用流式细胞分析外周血CD4+或者CD8+T细胞以及两者的比例。如表2所示，于第11天，组0和组1间，CD4+、CD8+细胞以及两者的比例差异有显著性；第11、19、23天，CD4+、CD8+细胞以及两者的比例在组1受者组内差异也有显著性（P＜0.01）。可见在免疫重建过程中，组1的CD4+辅助性T细胞于移植后30天，在比例和绝对数目上已经完全恢复；从CD4+/CD8+细胞比值看，骨髓移植后，比值明显升高了，一方面是CD4+的T细胞比例增加了，同时，CD8+T细胞比例减少了，CD8+的T细胞减少的幅度超过了CD4+的T细胞增加的幅度，结果CD4+/CD8+的比值，组1与组0相比，增加了3倍左右。在完全排斥的23天，其值达到最高峰（7.87）。表2 流式细胞分析结果注：于第11天，组0和组1间，CD4+、CD8+细胞以及两者的比例差异有显著性；第11、19、23天，CD4+、CD8+细胞以及两者的比例在组1受者组内差异也有显著性
3 讨论
皮肤移植是非常严格的移植排斥动物模型，皮肤是全身各种器官组织中最容易被排斥的组织，而且皮肤移植直观，操作相对简单［11］，所以我们选择它作为动物模型。在不使用系统性免疫抑制剂的情况下，我们在小鼠皮肤移植模型中成功诱导供者特异性免疫耐受，使皮片存活时间明显延长，对于C57BL/6来源的皮片，其MST达20天；相反，对于无关129鼠来源的皮片，其MST=10天。可能的耐受机制是复杂的：（1）可能是由于经同种移植激活的DCs携带供者特异性抗原，经尾静脉回输进入受鼠体内，然后随血液循环归巢到受者胸腺中，提呈供者抗原参与阴性选择过程，使受者在免疫重建过程中，大部分供者反应性的T淋巴细胞在胸腺水平经阴性选择由诱导凋亡克隆清除和克隆无能等机制去除掉，从而诱导对供者皮片的耐受，同时，在免疫重建的过程中，受者能保持对其他抗原的正常免疫应答；（2）也可能是供者抗原进入胸腺后，诱导调节性T细胞Treg细胞对供者产生特异性的免疫耐受。（3）还可能是由于同种移植激活的DCs携带供者特异性抗原进入体内后，激活同种反应性T细胞回流入胸腺所致。
从组3的结果可知，接受了致死量照射的受鼠在经过30天的免疫重建后，于第10天就完全排斥了无关129鼠的皮片，一方面说明该耐受诱导方案的特异性；同时也表明，受鼠具备了完整的免疫功能，流式细胞分析的结果也进一步证实了受鼠的免疫功能，如表2所示，在免疫重建过程中，组1的CD4+辅助性T细胞于移植后30天，在比例和绝对数目上已经完全恢复；从CD4/CD8细胞比值看，由于外周CD4/CD8的比值是由胸腺的微环境决定的，胸腺的输出对于该比值有决定性的影响，在正常的成年小鼠，其值介于2～4之间［12］；骨髓移植后，比值明显升高了。由于CD4+的细胞识别MHC Class II分子和外源性的抗原肽形成的复合体，因此推断可能是由于同种激活的DCs携带同种异型抗原分子进入胸腺后，一方面通过胸腺的阴性选择诱导细胞毒性的CD8+T细胞凋亡，因此外周CD8+T细胞的比例减少了近一半；同时，由于该方案诱导的是不完全的耐受，其MST=20天，移植术后不可避免的发生排斥反应，将导致了CD4+的T细胞数目增加，在完全排斥的23天，其值达到最高峰。
皮肤移植有高排斥性且操作简单，是良好的移植动物模型，但是在临床上多为自体皮肤移植，因此，我们也设想在今后的实验中尝试心脏移植、肾脏移植等其他的移植模型来进一步验证实验结果，期待能对将来的临床实体器官移植提供更有意义的参考；对于激活的DC细胞呈递的供者抗原，我们也希望能在今后的实验中进一步提取、纯化，以期待分析诱导移植耐受的优势表位；同时，我们也在设计进一步的实验来验证前文所述的诱导该免疫耐受方案的可能机制。(本文图片见封三)
(致谢：感谢北京大学人民医院肝病研究所的魏来教授，高燕教授提供指导和实验的部分场所；丛旭老师提供实验的技术支持)
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*基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：30471570)
作者单位： 100083 北京，北京大学医学部免疫学系(△通讯作者)
(编辑：秋 实)