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【摘要】 目的 以河南洛阳二里头遗址出土的距今3000多年的夏代人牙齿为标本，从口腔医学的角度分析牙齿DNA提取的污染控制，并进行PCR扩增条件的比较研究。方法 对古代人类牙齿样本进行去污处理，放入液氮研磨机中打磨成牙粉，使用GENECLEAN○R Kit for Ancient DNA 试剂盒从牙粉中提取DNA分子；利用不同条件的5种PCR反应体系扩增古DNA。结果 从牙齿样本中抽提出古代DNA片段A；在PCR扩增中，加入适量的小牛血清蛋白BSA有助于消除古代样本中PCR抑制物的作用；适合的Mg2+浓度则有助于增加DNA聚合酶的活性，减少非特异性扩增。结论 古DNA试剂盒是一种有效的古DNA抽提方法；小牛血清蛋白BSA和Mg2+浓度对PCR反应存在影响。
【关键词】 古代人类牙齿；DNA；提取；扩增；小牛血清蛋白; Mg2+
A study of extraction DNA from ancient teeth and the influences of amplifying conditions
SHI Lin，ZENG Xiang-long.Peking University School and Hospital of Stomatology，Beijing 100081，China
【Abstract】 Objective To extract DNA from human ancient teeth remains more than 3000-years-old excavated from Erlitou ruin in Henan province，and analyze the pollution control from dental aspect and study the influences of different conditions of PCR.Methods The teeth were cleaned and grinded into powder by FREEZER/MILL6750. DNA was extracted with ancient DNA extraction kit and amplified under 5 different polymerase chain reaction conditions.Results DNA was extracted from teeth powder; BSA helps to eliminate the effects of inhibitions; proper density of Mg2+ helps to increase the activity of TaqE and avoid the amplifying errors.Conclusion Ancient DNA extraction kit is a effective way to extract ancient DNA; BSA and the density of Mg2+ have influences on the results of PCR.
【Key words】 ancient teeth; DNA; extraction; amplify; BSA; Mg2+
牙齿是人体中最坚硬的组织，往往可以历经几千甚至上万年而不发生腐败和解体。DNA分子的片段可以在生物体死亡之后的很长时间内保存。利用现代分子生物学的手段提取留存在古代人类和动植物样本中的DNA分子，可以直接分析古代样本中的遗传信息。本研究作为国家自然科学基金资助项目，从河南洛阳二里头遗址出土的距今3000多年的夏代人牙齿标本中提取线粒体DNA序列，从口腔医学的角度分析牙齿DNA污染的控制，并对古代DNA进行PCR扩增条件的摸索和比较。
1 材料与方法
1.1 研究对象 本研究所采用的样本为中国社会科学院考古研究所二里头工作队提供的从河南洛阳二里头遗址出土的夏代人类牙齿三枚，都来自于同一个体。
本研究样本选择标准为：(1)非游离牙齿；(2)牙体完整，无明显裂纹；(3)牙周状况良好，无明显牙槽骨吸收；(4)牙齿所在牙槽骨保存状况良好；(5)同一个体具有多颗牙齿符合条件。(注：牙周病的判断参照毛燮均教授1959年研究安阳殷墟人骨牙周病的诊断标准，以牙槽骨的明显病变为标准，牙槽骨吸收达牙根的1/2者，才视为此病［1］。)
本研究的牙齿样本取自保存状况良好的下颌骨上。
1.2 研究方法
1.2.1 样本处理
在从下颌骨上取下用于实验的牙齿样本时，要充分考虑到古代骨骼标本比较干燥，脆性大。为防止牙根折断，暴露牙髓腔，造成污染，取牙时要十分小心。取下单根牙时，做唇舌向轻微晃动牙齿并稍加旋转。取下多根牙时，只可轻微晃动牙齿不可旋转，若单纯晃动无法将牙齿取下，则磨除部分牙槽骨以去除骨阻力以保证牙齿完整脱出。选择完整取出的牙齿进行去除表面DNA污染的处理：1N的盐酸浸泡5～10min，无菌双蒸水清洗，再用无水乙醇清洗，晾干；用紫外线照射牙样各侧面，每个侧面15min。将牙齿放入液氮研磨机FREEZER/MILL6750中打磨成粉。
1.2.2 提取DNA［2，3］
使用GENECLEAN○R Kit for Ancient DNA 试剂盒(所有试剂为无核酸污染试剂)提取存在于牙粉中的DNA，用于扩增目的片段。每次抽提均设空白对照。
1.2.3 古代DNA的扩增
抽提得到的是核DNA和线粒体DNA的混合物。本研究的目的片段位于线粒体DNA的高可变一区。这一区域是非编码区，具有突变速度快，无内含子，插入缺失较少，无重组现象等特点，因此它被广泛采用作为古DNA研究的目标片段。本研究采用吉林大学生命科学院古DNA实验室设计的引物来扩增古代个体的线粒体DNA高可变一区的DNA片段,引物设计严格遵循引物设计的原则［4］。DNA片段的扩增按Handt［5］的方法进行，操作过程在台式PCR防污染超净台中完成。PCR扩增反应采用12.5 l体系。为探索本研究样本的最佳PCR条件，研究小牛血清蛋白BSA和Mg2+浓度对扩增结果的影响，分别设计以下几种不同条件的PCR反应体系。见表1～5。 表1 PCR反应体系1表2 PCR反应体系2表3 PCR反应体系3表4 PCR反应体系4表5 PCR反应体系5 PCR扩增35个循环按以下程序进行：95℃ 5min，94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸1min，7个循环后进入92℃变性50s，50.3℃退火50s，72℃延伸1min，28个循环后，72℃延伸10min，4℃保持。每次PCR反应均设2个空白对照(扩增及抽提对照)。空白对照中以双蒸水取代抽提液。
1.2.4 PCR 结果的电泳观察
扩增结果用2％琼脂糖凝胶电泳观察，置于盛有1×TAE电泳缓冲液的水平电泳槽中，对PCR扩增产物进行电泳分析，电压为5V/cm。使用ImageMaster○R VDS凝胶成像仪进行观察，分析、记录。
2 结果
2.1 DNA的抽提结果
本研究从牙齿样本中提取出了50 l的DNA抽提液。在随后的DNA扩增反应中，抽提空白对照均为阴性，据此可以初步验证在提取过程中没有发生外源性的污染。
2.2 DNA的PCR扩增结果
5个PCR反应体系的电泳结果见表6、图1。表6 5个反应体系PCR扩增结果注：E0 为抽提空白对照；P0 为PCR空白对照；S1A为反应体系5的PCR扩增产物， E0左侧为反应体系4的扩增结果，为阴性， 其下方为引物二聚体。反应体系1、2、3电泳图略
3 讨论
3.1 关于实验过程的讨论 (1）由于实验样本干燥，脆性较大，从下颌骨上取牙时必须十分小心，防止牙根折断，暴露牙髓腔，造成污染。取下单根牙时，可唇舌侧轻微晃动牙齿并稍加旋转，原理同拔牙。而取下多根牙时，只可轻微晃动牙齿不可旋转，有时需磨除部分牙槽骨以去除骨阻力保证牙齿完整脱出。(2）取出的牙齿根部牙骨质表面颜色往往深于现代离体牙，这是由于土壤中的腐酯酸、褐菌酸导致了牙骨质的颜色加深，这些物质对PCR反应有抑制作用。经过去污处理的牙齿样本如果外观颜色呈现暗黄甚至褐色，往往提示其所含的PCR抑制物较多，不易扩增。如果牙齿呈白垩色，则说明样本的保存状况可能不错，易于扩增。(3）由于PCR反应体系很小，在向管中加样时要十分小心，尽量将样直接加至管底，而不要接触管口，因为这样极易造成污染。如果加样时有液体留于管内壁，可通过离心将液珠甩下，使加入的液体能够充分参加反应。
3.2 古代DNA的序列真实性［6］ (1）样本的选择：本实验中，用于研究的样本为牙齿。选取保存状况良好，牙齿完整，牙冠和牙根无裂纹、破损的样本用于实验，以尽量减少引入外源DNA 污染的可能性。(2）实验区域的划分：在实验空间的设计上，将实验室分隔成几个区域：样本处理区→DNA提取区→PCR准备区→PCR区→PCR结果观察区，实验中操作者按箭头的方向在这几个区域移动，禁止做反向活动。(3）实验对照组的设置：在实验过程中，每个PCR反应均设有提取对照和PCR空白对照组。提取对照是指提取过程中，不加入牙粉，其余所有步骤相同，用于观察提取试剂是否存在污染，PCR空白对照是指加入所有PCR成分只是不加入模板（提取物），而是以双蒸水补足模板的量，以观察PCR试剂是否存在污染。
3.3 PCR反应中的缓冲液 (1）KCl的浓度在50mmol/L下有利于引物的退火，超过50mmol/L的KCl则会抑制酶的活性。(2）BSA(1.3mg/ml)的加入可以帮助去除在抽提液中含有的一些不明成分(可能是腐殖酸、褐菌酸、鞣酸等)对Taq DNA聚合酶的抑制作用，增强酶的稳定性，消除样本中PCR反应抑制物的作用。(3)Mg2+浓度会影响酶的活性与忠实性，也影响引物的退火，模板与PCR产物的解链温度，引物二聚体的形成等等。一般来说，Mg2+浓度过低，酶活性显著降低；Mg2+浓度过高，会引起非特异性扩增。一般Mg2+浓度在0.5～2.5mmol/L之间，由于酶需要的是游离的Mg2+，但DNA模板，引物，dNTP的磷酸基团均可结合Mg2+从而降低Mg2+的实际浓度，因此PCR中的Mg2+浓度要比dNTP高出0.2～2.5mmol/L。另外，EDTA等螯合剂也会影响Mg2+浓度。
4 结论
古代DNA含量稀少，保存状况差。采用专门的古DNA试剂盒进行古DNA抽提是一种行之有效的方法，由于实验过程快速、简便，处理步骤少，减少了污染的机会。在古DNA的PCR扩增中，加入适量的小牛血清蛋白BSA有助于消除古代样本中PCR反应抑制物的作用。适合的Mg2+浓度则有助于增加DNA聚合酶的活性，减少非特异性扩增。
【参考文献】
1 毛燮均，颜阎.安阳辉县殷代人牙的研究报告.古脊椎动物及古人类，1959，1：81-84.
2 Connie J. Kolman，Noreen Tuross. Ancient DNA analysis of Human populations. American Journal of Physical Anthropology，2000，111: 5-23.
3 Dongya Y Yang，Barry Eng，John S Waye，J.Christopher Dudar，Shelley R.Saunders. Techical Note:Improved DNA Extraction From Ancient Bones Using Silica-Based Sin Columns.American Journal of Physical Anthropology，1998，105:539-543.
4 J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南.第三版.北京：科学出版社，2002，387-391，596-611.
5 Handt O，Richards M. Molecular genetic analyses of the Tyrolean Ice Man. Science，1994，264: 1775-1778.
6 Connie J Kolman，Noreen Tuross. Ancient DNA Analysis of Human Populations. American Journal of Physical Anthropology，2000，111: 5-23.
*基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：30271429)
作者单位： 100089 北京，北京大学口腔医学院·口腔医院(△通讯作者)
(编辑：秋 实)