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【摘要】 在管式炉中加热C60和Cl2使之反应生成C60Cln。C60Cln与银胺络合物复合，得到的C60Cln-银胺复合物，可以活化O2，并杀灭细菌。C60与PVP形成超分子复合物，可以杀灭细菌，推测体系中形成了超氧阴离子自由基O2·-。
【关键词】 C60； C60Cln； 杀菌
C60在水中几乎不溶.为了探索富勒烯的生物活性，首先要增加其在水中的溶解度。C60的水溶性衍生物具有奇妙的细胞毒性，神经毒性［1］，光诱导损伤性能。研究表明他们在抗菌［2］，抗癌，抗艾滋病毒，酶活性抑制［3，4］，切割DNA［5］，生物载体等方面具有独特的作用。因此，水溶性C60的开发对其在生物化学，生物医学，药物学等多学科领域的广泛应用具重要意义。我们在实验室以C60为起点，用加热法制备了C60Cln。为了研究C60极其衍生物的生物活性，制备了C60-银胺络合物及C60-PVP溶液发现它们可以活化氧气，杀灭细菌。
1 材料与方法
1.1 实验原料 C60： 用氮气氛存于干燥器内，青岛化工学院。Cl2： 99.99%，青岛化工学院。乙二胺：分析纯，淄博化学试剂厂。乙醇胺：分析纯，淄博化学试剂厂。草酸银：分析纯，淄博化学试剂厂。Al2O3分子筛：上海分子筛厂。使用前450℃活化5～6h。甲苯：分析纯，99.5%，淄博市临淄天德精细化工研究所。
1.2 实验方法
1.2.1 C60的氯化 称取一定量的C60粉末放于瓷舟内，将瓷舟放于管式加热炉中，通入氮气，加热升温至所需温度，恒温1h。通入Cl2，时间由每次实验所定。氯化完毕后，关掉电源，停止加热，冷却。完毕后，将瓷舟取出，称量，计算摩尔含氮量。
1.2.2 含富勒烯的银胺络合物的制备及抗菌性能
1.2.2.1 银催化剂的制备 称量8.7995 g草酸银，0.0166g氯化铯和100.2mg C60Cl18放入锥形瓶。加入5.7ml水，在40℃水浴中避光搅拌。将4ml乙醇胺和2ml乙二胺加入锥形瓶，并用5.7ml水洗涤残留的乙醇胺和乙二胺，在水浴中搅拌至溶解。将46g微孔陶瓷放入锥形瓶中，抽真空、鼓氮气，反复多次。在刚制备的银胺络合物溶液中加入经过处理的微孔陶瓷，避光存放两天。取出微孔陶瓷，用红外灯烤干后放入坩埚，在380℃的马弗炉中煅烧2h。
1.2.2.2 富勒烯-银胺络合物的抗菌性能 将微孔陶瓷装入石英管，通入氧气。先通入20min，保证石英管中充满氧气氛。然后封闭 15min，紫外灯照射，使氧气活化。将活化的氧气通入盛有细菌的试管中。在37℃恒温培养24h，观察细菌生长情况。
1.2.3 C60/PVP溶液的制备及抗菌性能
1.2.3.1 溶液的制备 在100ml CHCl3中溶解5g PVP，注入50ml甲苯溶液（含40mgC60），室温搅拌1h，回收溶剂，剩余溶剂用水浴蒸干，在真空干燥箱中减压除去溶剂。加入100mlH2O，溶解成透明的褐色溶液。在溶液中加入不同量的D2O，可延长O2的寿命。
1.2.3.2 抗菌实验 操作同1.2.2.2。
2 结果与讨论
2.1 C60Cln-银胺络合物的杀菌性能
2.1.1 空白样品Al2O3的杀菌效果 见表１。
表1 空白样品的杀菌效果（略）
空白实验中，细菌全部存活，说明空白分子筛不具备杀菌能力。
2.1.2 C60Cln-银胺络合物的杀菌效果 见表2～5。
表2 C60Cln-银胺络合物对气单胞菌杀灭结果（略）
含C60Cln 100mg 的C60-Ag（en）2复合物活化的O2通入含气单胞菌的碱性蛋白胨水中，再经TCBS琼脂培养，发现气单胞菌全部死亡。说明C60-Ag（en）2复合物可以杀灭气单胞菌，而且抑菌性能不受时间的影响。
表3 C60Cln-银胺络合物对金黄色葡萄球菌杀灭结果（略）
将活化的O2通入含金黄色葡萄球菌的胰蛋白胨大豆肉汤，再经B-P琼脂培养。采用营养平板法观察，发现没有存活的金黄色葡萄球菌，说明C60-Ag（en）2复合物可以杀灭金黄色葡萄球菌，其杀菌性能同样不受时间影响。
表4 C60Cln-银胺络合物对金黄色葡萄球菌杀灭结果（略）
减少复合物中C60的含量，使用40mg的C60Cln。采用上述方法，检测到复合物同样能杀灭金黄色葡萄球菌，且不受时间的影响。
表5 C60Cln-银胺络合物对弧菌杀灭结果（略）
改变受测试的菌种，将活化的O2通入含弧菌的碱性蛋白胨水中，再经4号琼脂培养，检测到复合物同样能杀灭弧菌。
2.1.3 C60Cln-银胺络合物的杀菌机理 细胞的存活是由活性氧和抗氧化剂的平衡决定的。氧自由基的增加或抗氧化水平的降低都会导致核因子（NFкB）活化，DNA的氧化并活化聚-ADP-核糖-转录酶（PADPRT），导致细胞凋亡［6］。活性氧对DNA 的损伤可以活化与细胞凋亡有关的多-ADP-核糖转移酶（PADPRC）和抗癌基因（P53）的积累。ADP-核糖在蛋白上的聚合，使细胞内NAD/NADH迅速耗尽，瓦解ATP。另外，活性氧导致细胞膜脂质过氧化，消耗多不饱和脂肪酸和胆固醇，这些都将导致细胞凋亡［7］。分子筛具有较大的比表面积，C60是球状的分子，都可以增加C60与O2的接触面积。C60和银两者均能活化氧气，复合后可以起到更好的杀菌效果。
2.2 C60-PVP溶液的杀菌性能
2.2.1 C60-PVP溶液的杀菌效果 见表6～11。
表6 空白PVP溶液的杀菌性能 （略）
空白PVP溶液不能活化O2，没有杀菌能力。
表7 PVP-D2O溶液的抑制气单胞菌性能（略）
在PVP- C60溶液中加入40mlD2O，活化后的O2通入含气单胞菌的碱性蛋白胨水中，经TCBS琼脂培养，发现气单胞菌全部死亡，说明PVP-C60溶液能杀灭气单胞菌。
表8 PVP-D2O溶液的抑制气单胞菌性能（略）
减少D2O的用量，使用25mlD2O，经上述方法仍然可以杀灭气单胞菌。
表9 PVP-D2O溶液的抑制弧菌性能（略）
进一步减少D2O的用量，用10mlD2O，活化后的O2通入含弧菌的碱性蛋白胨水中20 min，经4号琼脂培养，观察到弧菌死亡。
表10 PVP-D2O溶液的抑制大肠杆菌性能（略）
同样的溶液活化的O2通入含大肠杆菌的营养肉汤，经伊红美蓝琼脂培养，观测发现不存在存活的大肠杆菌，说明PVP- C60溶液能杀灭大肠杆菌。
表11 PVP溶液的抑制大肠杆菌性能（略）
在PVP- C60溶液中不加入D2O，将活化的O2通入含大肠杆菌的营养肉汤，经伊红美蓝琼脂培养，观测发现不存在存活的大肠杆菌，说明PVP- C60溶液可以活化O2，体系中的活性氧寿命高于杀灭细菌所需时间，不需要D2O延长寿命，因此PVP- C60溶液可以作为有效的杀菌体系。
2.2.2 C60-PVP水溶液的杀菌机理 C60不溶于水，但它与PVP形成络合物后，可溶于水，溶解度达400μg/ml。C60是有效的光敏剂，在光激发下可以活化氧气，生成单线态氧。单线态氧寿命较短，但可以一个电子生成超氧阴离子自由基。超氧阴离子自由基在水溶液中的存活时间约为1s，在脂溶性介质中的存活时间约为1h。它可以存活于气相，液相和固相中，又是所有氧自由基的前提，可以转化为其他氧自由基，参与细胞凋亡。
2.3 C60-PVP水溶液和C60Cln-银胺络合物的灭菌异同 虽然两者都是由C60光敏化激发O2生成活性氧，并由活性氧杀灭细菌，单两者仍然有一些不同之处。C60Cln-银胺络合物体系中形成的是单线态氧，在光敏化过程中还有银对氧的吸附及活化作用的参与。而C60-PVP体系中形成的是单线态氧的还原产物超氧阴离子自由基，由于PVP的存在，O2·-可以存活更长的时间，进而有可能产生各种活性氧，参与灭菌的过程。
3 结论
（1）用瓷舟盛放C60，放入管式炉中的玻璃管，加热通入Cl2，控制温度和时间，可以获得C60Cln。（2）C60Cln和银胺络合物复合，可以活化O2，活化后的O2可以杀灭细菌。（3）C60 和PVP形成复合物，可溶于水，改变了C60在水溶液不溶的性质。C60-PVP水溶液活化后获得的O2·-可以杀死细菌。
【参考文献】
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（编辑：海 涛）
作者单位： 266002 山东青岛，山东检验检疫局技术中心
山东青岛，青岛大学