O139霍乱疫苗人群现场试验及其评价

　　【摘要】 目的   了解O139霍乱疫苗人群现场试验及其评价的方法。方法   综述近年来国内外文献中进入现场试验的O139霍乱疫苗种类及其试验方法。结果   在自愿者中主要进行了灭活疫苗（肠道外和口服）、减毒活疫苗（口服）的试验，都显示出具有一定的免疫效果；试验人群主要选择成人组和儿童组，样本量要足够大；试验中采取随机、双盲、对照的方法是避免试验中产生偏倚的条件。结论   口服疫苗WC/rBS和BenGal-15有较好的研究前景，构建对O1群各血清型、O139都具有长期保护作用的多价疫苗是未来的研究方向。

　　【关键词】 O139霍乱疫苗；现场试验；评价

　　人类历史上共记载了7次霍乱的流行。最近一次是1961年从印度尼西亚开始，20世纪70年代延伸到了非洲大陆，1991年到了南美洲。据报道1994年美洲大陆霍乱病例超过100万，近1万人死亡。据估计世界上每年有12万人死于霍乱［1］。然而，从1992年10月开始，一种新的血清群（O139或Bengal）被发现，并在南亚地区造成广泛流行。1993年O139传入我国，主要在华南沿海地区流行。O139是EITOr的衍生株，但是它却有新的基因信息编码的种独特的脂多糖O抗原和一个多聚糖包囊，流行病学资料显示，先前对O1群霍乱具有的免疫力，对O139几乎不起作用［2］。因此，在全球急需一种对抗O139感染的有效疫苗。基于在研究O1群霍乱疫苗上的经验和教训，最近几年来，国内、外已有不少O139的疫苗进入动物或人群试验，并取得了相当的进展。为此，本文对O139霍乱疫苗的人群试验作一简要的回顾。

　　1 试验人群选择
　　
　　与O1群霍乱不一样，O139霍乱虽然可发生于居住在卫生条件较差的热带、亚热带地区的人群，但是目前主要在亚洲特别是在它的出生地南亚地区流行，易感者为妇女及年龄＜5岁的儿童。因此，试验人群应来源于依从性较好的O139霍乱流行区的居民或志愿者以及在难民营和可能到流行区去的旅游者［2］。目前，人群试验主要在美国、越南、中国等国进行［3～5］。如D.D. Trach2002年报道在越南的247名志愿者中进行的人群试验，其中成人（17～25岁）144人，儿童（1～12岁）103人，儿童组在对成人组试验后且被证明无严重副反应的情况下进行。蒋仁生等［5，6］1997年报道在中国广西的697名14～18岁身体健康的初、高中学生进行的现场试验。吴辉绪等2003年在广州某军校450名17～22岁健康学员中进行了现场试验［7］。

　　2 疫苗种类、免疫次数与剂量

　　2.1 肠道外疫苗  

　　到目前为止，已经研制了多种肠道外O139霍乱疫苗，主要是灭活全菌体菌苗、灭活铝佐剂免疫吸附菌苗等。在人群试验中表明，肠道外疫苗可诱导中等短期中等强度保护作用。在中国广西［6］进行了随机、对照、双盲的O139灭活全菌体现场试验中，间隔10天经上臂外侧三角肌附着处肌肉注射，第1剂22.5亿、第2剂67.5亿，共90亿O139死菌苗后，能产生一定的抗菌抗体和抗毒抗体，但只限于应急接种。

　　2.2 口服疫苗

　　2.2.1 灭活全细胞菌苗（WC）  

　　最初的WC疫苗是针对O1群霍乱的，并在越南的现场试验中取得了不错的保护效果［8］。随后，NIHE根据WHO腹泻病疫苗筹划指导委员会的建议，研制成第2代灭活的全细胞二价菌苗，这种菌苗由O1群和O139霍乱弧菌全细胞构成，其中包含了5×1010cfu福尔马林灭活的O139（AI4456）。在Hanoi的研究是口服2剂，每剂1.5ml，间隔2周，但是免疫效果不理想，并且与是否使用抗酸剂无关［3］。

　　2.2.2 B亚单位—全细胞菌苗（rBS-WC）  

　　在预防O1群霍乱方面，这种由重组的霍乱毒素B亚单位和灭活的O1群霍乱全细胞组成的口服疫苗，已经取得了不错的效果［1，9，10］，因此在20世纪90年代已经进入市场。瑞士Marianne Jertborn等利用福尔马林灭活O1/O139构建的二价B亚单位—全细胞菌苗（rBS-WC）在现场试验人群中已取得了不错的效果［11］。国内军事医学科学院刘传暄等与兰州生物所用重组B亚单位和灭活的O139全菌体重新构建的O139灭活菌苗，动物免疫试验显示出良好的效果［12～14］。

　　2.2.3 O139型减毒活菌苗  

　　Bengal-15是一类基因工程减毒株，它是由Bengal-3的非动力衍生株分离而来，具有attRS1缺失（去除编码CTA亚单位和其他两个毒素基因）和recA缺失。Bengal-15具高度重组稳定性，是O139霍乱菌苗的候选株，在志愿者口服108cfu1个月后，用O139霍乱弧菌攻击试验结果，保护率为83％［3］。

　　3 评价

　　理想的霍乱疫苗应具有较高的安全性，对隐形或显性霍乱感染有长期保护作用，服用方便，免疫后能快速产生免疫反应，价廉，对各种血清型和生物型都具保护作用［2］。因此，目前对O139霍乱疫苗的评价主要有以下几个方面。

　　3.1 方法  

　　是否采用随机、双盲、对照法，是评价结果是否产生偏倚的条件。

　　同霍乱O1群的现场试验一样，人群样本量的大小取决于所要获得的评价指标。评价保护效果、安全性时样本量要求足够大，有时可达几十万人［8］；血清抗体检测和攻击性试验需几十人或几百人［4，5］。

　　3.2 安全性 
 
　　霍乱疫苗的安全性主要是从受试者免疫后是否有恶心、呕吐、腹痛、腹泻（≥3次/24h，且伴随大便性状的改变）、发热、全身或局部的过敏反应等方面进行评价，且在腹泻者的粪便标本中是否检测到与测试疫苗有关的抗原。比较之下，肠道外疫苗比口服疫苗的副作用大，减毒活疫苗比灭活全菌体菌苗的副作用要大，同时也存在着毒力基因在自然界重新获得的可能性。另外，抗酸剂（碱性缓冲液）的使用，也加重部分受试者的胃肠道反应［3～5］。为此，一种新型肠溶型冻干胶囊剂灭活全菌体加重组B亚单位疫苗（rBS-WC），在服用疫苗时不须服用碱性缓冲液，是一种很有推广前途和实际应用价值的疫苗。

　　3.3 免疫效果评价  

　　对于O1群霍乱疫苗，一般认为血清Vab抗体和抗毒素抗体（抗-CT）滴度是基础抗体的2倍或以上，就确定为抗体阳性［15］。然而，Trach D.D.在越南现场试验口服全菌体2价疫苗时，仍然规定抗体升高4倍或以上才确定为抗体阳转［4］。另外，疫苗的免疫原性不能单从抗体阳转率或抗体效价升高来评价。免疫效价的高低，一般与免疫剂量呈正相关，疫苗的免疫剂量太低达不到必需的免疫效价，但是，另一方面，剂量太高也可能产生免疫抑制。还有，也与是否感染过相同血清型的霍乱、接种过相同血型的霍乱疫苗有关。因此，如果体内存在一定的抗体滴度，接种疫苗后抗体滴度升高不明显，不能认为缺乏免疫原性，而还要考虑其他影响因素。

　　口服灭活全菌体疫苗的主要缺点是全程免疫需要2～3次服苗，每次间隔1～2周，且免疫效果较差［4］。而正在进行现场试验的灭活全菌体加重组B亚单位疫苗可作为有潜力的候选疫苗。

　　3.4 保护效果  

　　作为一种效果理想的疫苗，应是接种方便，最少的免疫剂量与次数，产生免疫抗体滴度高，保护作用时间长。兰州生物所研制的死菌苗，皮下注射后，能产生一定水平的抗菌抗体和抗毒抗体，维持期超过3个月。另外一种在越南试验的灭活全细胞二价口服疫苗，在现场试验者中有40％受试人员产生4倍以上抗体升高［4］。由Bengal-15制成的口服疫苗，免疫1个月后，攻击试验的保护率达83％［3］。

　　流行病学指标对评价疫苗的保护效果方面意义及影响较大。在疫苗接种和发病的监测上，失访率过高，对照设置不合理，都会造成评价指标偏离真实值，产生系统误差。

　　成本效益问题是影响疫苗推广的一个关键因素。注射用疫苗，成本高，接种时操作繁琐，副反应大，又加上是液体疫苗，运输和保管中损耗较大，无疑又增加免疫成本，固推广较难。灭活的全菌体加上基因重组的B亚单位，制成冻干肠溶型胶囊型疫苗，在预防O1群霍乱的现场试验中，取得了比较理想的效果，重新构建的O139类似疫苗，应该拥有广阔的应用前景。

　　在新一代疫苗的现场试验中，证实WC/rBS和BenGal-15在现场有较好的保护作用，筛选一种以上的有长期保护作用，并构建对O1群各血清型、O139都具有保护作用的多价疫苗，进行完善的现场评价，相信对全球霍乱的预防会有较大的促进作用。

　　【参考文献】

　　1 WHO. Cholera vaccine. Wkly Epidem Rec,2001,76(16):117-124.

　　2 John J Mekalanos,Jerald C Sadoff．Cholera Vaccines: Fighting an Ancient Scourge. SCIENCE,1994,265:1387-1389.

　　3 Trinka S Coster,Kevin P Killen,Matthew K Waldor,et al. Safety,immunogenicity,and efficacy of live attenuated vibrio cholerae O139 vaccine prototype. Lancet，1995,345(8955):949-952.

　　4 D.D. Trach,P.D. Cam,N.T. Ke,et al. Investigation into the safety and immunogenicity of a killed oral cholera vaccine developed in Viet Nam. Bulletin of the World Health Organization，2002,80:2-8.

　　5 蒋仁生，凌文武，袁佩娜，等．O139型霍乱菌苗人群副反应观察报告．微生物免疫学进展，1997，25（1）：1-4.

　　6 袁佩娜，董思国，罗建辉，等．O139霍乱灭活全菌体免疫后人群抗体水平测定．微生物免疫学进展，1997，25（1）：6-12.

　　7 吴辉绪，陈清，李建栋，等. 口服霍乱疫苗O139rBS-WC后肠道菌群的改变. 第一军医大学学报，2004，24（2）：220-222.

　　8 Trach DD,Clemens JD,Ke NT,et al. Field tial of a locally produced, killed,oral cholera vaccine in Viet Nam. Lancet,1997,349(9047): 231-235.

　　9 陈清，俞守义，王雅贤，等.冻干口服霍乱rBS-WC菌苗安全性及免疫原性的人群试验.中华预防医学杂志，1996，30（6）：330-333.

　　10 甄蓓，俞守义，陈清，等．冻干口服霍乱rBS-WC疫苗现场试验及评价．中国计划免疫，1999，5（4）：210-214.

　　11 Marianne Jertborn,Ann-Mari Svennerholm,Jan Holmgren. Intestinal and systemic immune responses in humans after oral immunization with a bivalent B subunit-O1/O139 whole cell cholera vaccine. Vaccine,1996,14(15):1459-1465.

　　12 刘传暄，张艳红，马清钧．rBS-WC(O139)霍乱疫苗的小鼠免疫试验.军事医学科学院院刊，1997，21（3）：172.

　　13 刘传暄，马清钧,张艳红，等．预防O139霍乱B亚单位/全菌体口服疫苗的研究．中国生物制品学杂志，2002，15（2）：101-104.

　　14 陈翠萍，宣俊文，王永谦，等．O1/O139新型霍乱疫苗口服免疫动物后的自动免疫保护及被动保护试验研究．微生物学免疫学进展，2003，31（3）：18-21.

　　15 Sanchez JL,Castellares G,Ruiz R,et al. Safety and immunogenicity of the oral,whole cell/recombinant B sunbunit cholera vaccine in North American volunteers. J Infect Dis,1993,167:1446.

　　作者单位： 1 510288 广东广州，广州市海珠区疾病预防控制中心

　　2 广东广州，南方医科大学流行病学教研室