人源抗狂犬病毒特免血浆筛查方法的建立 2006年第6卷第8期 | 39康复网

【摘要】目的建立测定人体血清抗链球菌C多糖（ACHO，ASP）抗体的酶联免疫（ELISA）方法，探讨其临床价值。方法以胰蛋白酶消化后的整个链球菌细胞作包被抗原，建立测定血清抗-ACHO抗体的ELISA方法;用该法测定58例风湿热和复发风湿活动患者，56例风心病静止期和48例对照组病人血清抗-ACHO抗体，其中58例风心活动患者同时用Bar_ˉrett法测定;以Barrett法作标准，对该法进行初步评价。结果（1）该法的敏感性为93.5%、特异性为86.7%、准确性为93.1%、阳性预测值为95.3%、阴性预测值为86.7%、批内差异6.7%、批间差异12.8%。（2）风湿活动期组病人血清抗-A_ˉCHO水平P/N值（2.58±1.26）和阳性率（74.1%）明显高于风心病静止期组和对照组病人（P<0.01）。结论该法检测血清抗-ACHO抗体具有较高的敏感性和特异性，方法简便，抗原易获得，容易在临床和科研中推广应用。

关键词链球菌酿脓 C多糖酶联免疫吸附测定风湿热

Detection of antibody group A streptococcal C carbohydrate by

ELISA and its clinical significance

Chen Jianguang，Dong Taiming，Su Jian，et al.

Rheumatic Fever Laboratory，Guangdong Provincial Cardiovascular Disease Institute，Guangzhou510100.

【Abstract】 Objective To establish an enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method for group A streptococcus cell wall carbohydrate（ACHO）antibody in human sera and to evaluate its clinical significance.Meth_ˉods Group A streptococcal whole cell with trypsin-treated were used as coating antigen to develop and ELISA for the detection of anti-ACHO antibody in human sera.Anti-ACHO antibodies of58patients with active rheumatic heart disease，56patients with inactive rheumatic heart disease and48non-rheumatic heart disease patients were de_ˉtectedby this method.The58patients with active rheumatic heart disease were also underwent Barrett’s test that with purified ACHO as antigen.Barrett’s was regardedas a gold standard，and this method was evaluated.Results （1）The sensitivity and specificity of our method were93.5%and86.7%respective;the accuracy was92.3%;the posi_ˉtive and negative predictive values were94.3%and89.6%respectively;the intra-assay coefficient of variation（CV）was6.7%;and the inter-assay CV was12.8%.（2）Levels P value（2.58±1.26）and positive rates（74.1%）of serum anti-ACHO antibody in patients with active rheumatic heart disease group are much higher than those of inactive rheumatic disease group and non-rheumatic heart disease patients（P<0.01）.Conclusion The ELISA method that we have established for anti-ACHO antibody can be used in clinical and experimental study on the group A streptococcal infection，because the method is simple，sensitive and specific and the antigen can be prepared easily.

Key words streptococcus pyogenesis C carbohydrate enzyme-linked immunosorbent assay rheumatic fever

风湿热（RF）活动在临床诊断上仍是一个难题。有研究表明，测定血清抗-ACHO抗体对诊断风湿热活动有很高的临床价值 ^［1，2］。但由于测定抗-ACHO抗体的方法目前尚在试验阶段 ^［2］，而且方法繁杂，试剂昂贵，难以在临床推广。我们建立了一种简易、经济、特异性高的ELISA方法测定抗-ACHO抗体，以期有助于RF的诊断和抗-ACHO抗体的进一步研究。

1 材料与方法

1.1 研究对象共162例，均为1998～2002年本院住院病人。其中风心活动期病人58例，年龄8～67岁（平均21±12岁），符合最新修订的风湿热诊断Jone氏标准 ^［3］ ;风心病静止期病人56例，年龄8～51岁（平均34±11岁），经心脏听诊、心脏B超、X线胸片、心电图等确诊，实验室检查无风湿活动证据;对照组病人48例，年龄2～60岁（平均23±19岁），均为排除风湿性心脏病的其他心脏病病人。所有病人清晨空腹静脉取血3ml，新鲜分离血清置-20℃，备用。

1.2 主要试剂 A族链球菌（GAS）标准菌标（32132A），美国明尼苏达大学世界卫生组织链球菌协作和参考研究中心提供;碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体（二抗），SIGMA公司产，效价1:5000;对硝基苯磷酸酯（底物），SIGMA公司产;聚乙烯醇，广州医药公司进口分装;牛血清蛋白，北京双旋微生物培养基制品厂。

1.3 实验方法

1.3.1 抗原的制备从血平板上选择纯的GAS（标准菌株）于托氏肉汤中扩大培养（37℃，18h），然后将培养液置56℃水浴30min灭活细菌，1500r离心15min，收集沉淀物，用消毒过的PBS（pH7.4）洗涤5次，收集沉淀物置4℃备用。

1.3.2 ELISA方法的建立（1）包被:以50mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9）将上述抗原稀释成3×10 ⁸ /ml（细菌数），包被96孔聚乙烯板（50μl/孔），37℃温箱烘干，用0.05%的Tween-20PBS洗涤3次。（2）封闭:每孔加入含1%聚乙烯醇PBS（pH7.4）200μl，37℃1h，洗涤3次。（3）加样:每孔加入待测血清50μl（1:4000稀释），每板设一正常对照、阳性对照及空白（PBS），37℃1h，洗涤3次。（4）加入酶标二抗每孔100μl，37℃1h，洗涤3次。（5）显色:每孔加入底物100μl，37℃1h。（6）比色:以空白调零，405nm波长测定光密度（O.D）。（7）结果判断:P/N=测定标本O.D均值/阴性血清O.D均值，以P/N≥2.1为阳性。

1.3.3 方法学质控同一标本同次重复20孔，计算批内差异;同一标本不同批次连续检测20次，计算批间差异。

1.3.4 Barrett法（以纯化的ACHO作抗原）按文献资料报告进行 ^［4］。

1.4 统计方法以Barrett法作标准，按照诊断实验评价方法采用四格表分析，计算敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值。两法比较用配对计算资料X ² 检验和直线相关分析。均值的比较用U检验，率的比较用X ² 检验。

2 结果

2.1 实验条件包被抗原的浓度、血清稀释度、反应温度、反应时间等均由棋盘试验确定。

2.2 本法与Barrett法结果比较见表1，两法检测结果差异无显著性。（X ² =0.25，P>0.05），且存在正相关（r=0.95，P<0.01）。本法检测抗-ACHO抗体的敏感性为95.3%、特异性为86.7%、准确性为93.1%、阳性预测值为95.3%、阴性预测值为86.7%。

作者：周耀东，周海云，杨庆梅，邹云，胡军，何彦林，赵永