点击显示 收起
【摘要】 采用水生毒理联合效应相加指数法，比较了有机磷农药甲基对硫磷和毒死蜱的单剂和混合剂对中肋骨条藻的急性毒性和联合毒性。结果表明:两种有机磷对中肋骨条藻的毒性大小为：毒死蜱 >甲基对硫磷；两种有机磷混合溶液对中肋骨条藻的联合毒性 96h 内均为协同效应。
【关键词】 甲基对硫磷； 毒死蜱； 中肋骨条藻； 联合毒性
Study on the joint toxicity of methyl parathion and chlorpyrifos for skeletone macostatum (Grev.) Cleve
WANG Ling， LI Xian-chun,HAN Xiao-tian,et al.
Chemical Defence Academy, Beijing 102205,China
【Abstract】 Using the addition method of index in aquatic toxicity, compared the acute and joint toxicity of methyl parathion and chlorpyrifos (single or complex) to Skeletone macostatum (Grev.) Cleve . The results showed that the toxicity of the organophosphorus pesticides(OPPs)to the mecroalgae is in the order of chlorpyrifos >methyl parathion, and the two OPPS show synergism on their joint toxicity in 96 hrs to Skeletone macostatum (Grev.) Cleve.
【Key words】 methyl parathion; chlorpyrifos; skeletone macostatum; joint toxic action
具有杀虫力强、适用范围广等特点的有机磷农药，在农业病虫害防治上起到了重要作用，但也不可避免地污染了周围环境，危害非靶生物。农药对海洋的污染，主要是通过施用时散落在田间的农药，随雨水等冲刷或工厂的“三废”排放造成的。这不可避免地对海洋生物造成危害。海洋微藻是近岸海域的初级生产者，是鱼、虾、贝的主要饵料生物，因此，开展有机磷农药对海洋微藻的毒性研究工作，对探讨有机磷农药污染对近岸海域初级生产力的影响具有重要意义。为此，国内外开展了大量的研究工作。中肋骨条藻属硅藻类，是渤海、黄海的优势藻种［1］，可作为饵料藻，已被证实是引发赤潮的主要藻种之一。甲基对硫磷和毒死蜱是我国北方沿海地区曾经或正在大量使用的有机磷农药，它们的分子结构式如图1所示。有关甲基对硫磷和毒死蜱对中肋骨条藻毒性效应的研究均未见报道。本文以中肋骨条藻以及甲基对硫磷和毒死蜱为研究对象，较为系统的研究了有机磷农药对海洋微藻的毒性效应。
在联合毒性的评价和危险评价中，汝少国［2］等认为采用 48h 或 72h 的EC50值较为客观。这是因为，有机磷农药的 EC50 随培养时间、pH、实验条件等变化很大。一方面，随处理时间的延长，藻体繁殖增快，自身产生生物稀释效应［3］；另一方面，有机磷农药遇水易分解［4,5］，生成的降解产物对藻的毒性有较大变化。本文利用荧光光度仪测定微藻生长的方法，研究了有机磷对微藻的毒理效应；采用 72h-EC50 作为评价指标。
图1 有机磷的分子结构式（略）
Figure 1 Molecular structure of Organophosphorus pesticides
(a) 毒死蜱 (chlorpyrifos) (b)甲基对硫磷（methyl parathion）
1 实验材料
1.1 试剂 甲基对硫磷［国家农药质检中心（沈阳），纯度≥99.1%］；毒死蜱［国家农药质检中心（沈阳），纯度≥99.3%］。甲基对硫磷和毒死蜱分别用丙酮配制成1000mg/L的标准贮备液，置于4℃ 冰箱中保存。
其他试剂包括丙酮、NaNO3、NaH2PO4·H2O、 Na2SiO3 ·9H2O、 FeCl3·6H2O、Na2EDTA·2H2O、CuSO4 ·5H2O、Na2MoO4·2H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O 、MnCl2·4H2O、Vitamin B12、Biotin、 Thiamine·HCl均为分析纯（上海化学试剂公司）。
实验用水为用 Millipore Milli-Q50（Millipore Corp., Waltham, MA, USA）新鲜制备的去离子水（18MΩ）；海水采自青岛石老人近岸，经 0.45μm玻璃纤维滤膜过滤，高温灭菌。
1.2 仪器设备 Hitach F-4500 荧光分光光度计（日本岛津公司）；磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）；EZ-Dry Kinetic 冷冻干燥机（美国）；AJ100 型电子天平（Mettler-Toledo 公司，瑞士）；Milli-Q50超纯水处理系统（Millipore 公司，美国）；TOMY Autoclave SS-325 高压灭菌锅（TOMY 公司，日本）；LRH-250G 光照培养箱（广州医疗器械厂）；Nikon Alphaphot YS 型显微镜（Nikon，日本）。
2 实验方法
2.1 藻类的培养及有机磷的投加 中肋骨条藻(Skeletone macostatum (Grev.) Cleve)由中科院海洋所微藻室提供，培养温度为 （25±1）℃ ，光强 3500 Lux，光暗周期昼/夜为12h∶12h，培养液为 f / 2 培养液，所用海水取自青岛近岸石老人的天然海水，经孔径 0.45μm 的玻璃纤维滤膜过滤，煮沸消毒。实验使用 250ml 的三角瓶，实验体积 200ml，每处理组3个平行样。接种前，先加入相应实验浓度的有机磷标液，平衡24h，以消除器壁对有机磷的吸附。接种后，立即取样，分别进行荧光光度法和气相色谱法的测试，以后每隔 24h 取样。在培养期间经常摇动三角瓶，实验重复 3次。实验所用器械均经高压蒸锅灭菌。
2.2 藻类生物量的测定
2.2.1 藻细胞浓度-藻液荧光光度标准曲线 取高浓度的藻液，用超纯水按浓度减半的原则稀释成一定的浓度梯度，每份样品分别用血球计数板计数和进行荧光测试，根据实验结果，绘制相应的对照曲线。
2.2.2 血球计数板法 藻细胞密度的测定，以 Lugol 碘液固定样品，显微镜下血球计数板计数，每个样品重复3 次。
2.2.3 荧光光度法 在激发波长 466nm时，扫描600～730nm范围，以 679nm 处发射峰进行定量分析。
2.2.4 荧光光度法与细胞计数法实验结果对照 接种当天测定藻液在 679nm 处的发射峰高度，然后每隔 24h 测定一次，从藻细胞浓度-藻液荧光光度标准曲线查出对应的藻细胞浓度。
2.3 毒性实验
2.3.1 单一有机磷对两种海洋微藻的急性毒性效应 在预备实验的基础上，设置0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L 共5个浓度组，每一组有两个平行样，并设 1个对照组。在 250ml三角瓶中加入150ml同一批藻液，藻液的初始密度为4.88×104个/ml。藻类生长死亡情况用 Hitach F-4500型荧光光度计，在激发波长为 466nm时，测定679nm处的波长。同时也用显微计数法进行直接测定，以作对照和比较。分别在 24、48、72 和 96h 取样分析，按公式（1）计算其相对生长率，再以浓度的常用对数为横坐标，抑制百分率的概率单位为纵坐标绘制生长效应曲线，算出半数有效浓度 EC50。K=lgNt-lgN0 T （1）其中：Nt：培养ｔ时刻的细胞密度；N0：起始细胞密度；T：为培养时间（d）；K：相对生长率。
2.3.2 联合毒性实验 在单一毒性实验的基础上，按甲基对硫磷∶毒死蜱浓度比为1∶1进行5个浓度组的急性毒性实验。每个实验组设两个平行样，分别记录 24、48、72 和96h 藻类生长死亡情况。
2.3.3 联合毒性的评价方法 联合毒性效应采用 Marking 的相加指数AI（Additive Index）法［6］。首先分别求甲基对硫磷和毒死蜱及其混合物对中肋骨条藻的半数有效浓度EC50，用公式（2）求出混合毒物生物活性S；然后根据公式（3）、（4）求出AI。用AI判断联合毒性作用，AI>0时，为协同作用；AI<0时，为拮抗作用；AI=0时，为相加作用。S=Am Ai+Bm Bi(2)其中：S：混合毒物生物活性；A，B：实验毒物；m：混合毒物的EC50；i：单一毒物的EC50。AI与S的关系为：S<1时：AI=1 S-1.0（3）S≥1时：AI=-1 S+1.0(4)
3 结果与讨论
3.1 生长量的变化 图2为中肋骨条藻在不同藻细胞浓度下，通过显微计数的藻细胞浓度（C）和测定的荧光强度（A）之间均有很好的线性关系。中肋骨条藻藻细胞浓度（C2）和测定的荧光强度（A2）线性回归方程为C2（106/ml）=-1.8382+0.851A2（R2= 0.9937），此方程算出的藻细胞浓度与实测值之间平均相对偏差为 3.1%。因此，为了计算方便，本研究中藻细胞的生物量直接以荧光强度值表示。
图2 中肋骨条藻荧光强度与藻细胞密度对照曲线（略）
Fig 2 Linear relationship between algae cell density of Skeletone macostatum (Grev.) Cleve and fluorescence at 679nm
3.2 甲基对硫磷和毒死蜱分别对两种藻生长的影响 图3～4 反映了不同浓度、不同处理时间甲基对硫磷和毒死蜱分别对中肋骨条藻生长的影响情况。可以看出，低浓度和短时间的处理可以刺激其生长，而高浓度长时间的处理对生长有抑制作用。不同有机磷农药引起生长刺激的时间与浓度有所不同：中肋骨条藻在甲基对硫磷丙酮溶液处理下生长刺激现象开始不明显，第5 天起在小于0.1mg/L甲基对硫磷丙酮溶液处理下开始出现生长刺激现象。毒死蜱丙酮溶液即使浓度很低（<0.1mg/L）亦对其生长有抑制现象。
中肋骨条藻分别在 5mg/L毒死蜱丙酮溶液以及 10mg/L 甲基对硫磷丙酮溶液胁迫下，培养72h时的细胞密度均小于起始密度，反映出藻细胞已受到严重的伤害，此时藻体已不能繁殖，生长完全受到抑制。这说明，不同的有机磷处理浓度及不同的作用时间对藻细胞生长的影响也不同。藻类的生长涉及到光合作用、呼吸和细胞分裂等过程，干扰和破坏其中任何一个环节均会导致藻类生长受阻。有关甲基对硫磷和毒死蜱对中肋骨条藻生长的生理生化影响，有待进一步研究。
3.3 甲基对硫磷和毒死蜱对中肋骨条藻的毒性效应 实验测得甲基对硫磷和毒死蜱对中肋骨条藻生长的单一毒性作用的半数抑制浓度 EC50见表1，联合毒性作用的半数抑制浓度 EC50见表2。由表1可见，依 72h-EC50值，两种有机磷对中肋骨条藻的毒性大小为：毒死蜱>甲基对硫磷。
图3 甲基对硫磷对中肋骨条藻生长的影响（略）
Fig 3 Effects of parathion methyl on growth of Skeletone macostatum (Grev.) Cleve
图4 毒死蜱对中肋骨条藻生长的影响（略）
Fig 4 Effects of chlorpyrifos on growth of Skeletone macostatum (Grev.) Cleve
表1 有机磷农药对中肋骨条藻的EC50 （略）
Table1 EC50 of methyl parathion and chlorpyrifos to Skeletone macostatum (Grev.) Cleve
表2 有机磷农药对中肋骨条藻的联合EC50 （略）
Table.2 Joint EC50 of methyl parathion and chlorpyrifos to Skeletone macostatum (Grev.) Cleve
不同浓度甲基对硫磷和毒死蜱的混合溶液（体积比1：1）处理中肋骨条藻生长曲线如图5所示，经统计分析，两种有机磷溶液对微藻的联合毒性见表3。
图5 甲基对硫磷和毒死蜱混合溶液对中肋骨条藻生长的影响（略）
Fig 5 Effects of parathion methyl and chlorpyrifos on growth of Skeletone macostatum (Grev.) Cleve
3.4 两种有机磷对中肋骨条藻和小角毛藻的联合毒性评价 浓度配比为1∶1的甲基对硫磷和毒死蜱对中肋骨条藻的联合毒性评价结果见表3。根据评价结果可见甲基对硫磷和毒死蜱对中肋骨条藻的联合毒性为协同作用。
表3 甲基对硫磷和毒死蜱丙酮液对两种海洋微藻的联合毒性评价（略）
Table 3 AI values of joint toxicity of methyl parathion and chlorpyrifos to Skeletone macostatum (Grev.) Cleve
4 小结
大多数单细胞藻类对农药均比较敏感。作为初级生产力，其在水域食物链中占有重要的地位［7,8］。因此，评价农药对水域环境污染时研究农药对藻类的中毒症状和毒性影响具有十分重要的意义。本实验结果表明，依72h-EC50值，两种有机磷对中肋骨条藻的毒性大小为：毒死蜱 > 甲基对硫磷。两种有机磷混合丙酮溶液对中肋骨条藻的联合毒性 96h 内均为协同效应。
把两种有机磷污染物对中肋骨条藻的72h-EC50值，按渡修明［9］、金泽纯［10］的有机磷杀虫剂对水生生物毒性的分类标准：剧毒为EC50<0.5mg/L；高毒为0.5mg/L < EC50<2 mg/L；中等毒性为 2mg/L<EC50<10mg/L；低毒为 EC50<10mg/L进行分类，结果甲基对硫磷的丙酮溶液对中肋骨条藻为中等毒性；毒死蜱的丙酮溶液对中肋骨条藻为剧毒。
【参考文献】
1 刘慧. 莱州湾和桑沟湾养殖海区浮游植物的研究Ⅰ.海洋水产研究,2003,24(2):9-17.
2 汝少国.十种有机磷农药对扁藻的毒性.环境科学学报,1996,16 (3):337-341.
3 Vatrawali M S. Mechanism of cell destructive action of organophorus insecticide phosalone in Clamy domonas reinhardtii algal cells. Bull Environ Contain Toxical，1990, 44(6):819.
4 王连生. 有机污染物化学. 北京:科学出版社,1994， 80-130.
5 山本亮.农药学.东京:南京堂，1964，30-120.
6 Marking L L. An Approach for Additive Toxicity of Chemical Mixtures. In: Mayor L L, Hamelink J L,eds; Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation; ASTM STP 634. American Society for Testing and Materials. Philade. phia, 1977, PA 990
7 张爱云，蔡道基. 农药对藻类的毒性与危害性评估. 蔡道基.农药环境毒理学研究. 北京:中国环境科学出版社,1999,128-134.
8 Statton G W. Effect of the solvent acetone on menbrance integrity in the green algae Chlorella pyrenoidosa. Bull Environ Contam Toxicol, 1989, 42: 754-760.
9 渡修明.水产增殖,1993, 41(4):511.
10 金泽纯. 水生生物七农药. 廿才工夕于才又卜社. 1979
(编辑：悦 铭)
基金项目：国家“十五”863项目（项目编号：2003AA635180）
作者单位： 102205 北京，防化研究院
266061 山东青岛，国家海洋局第一研究所
266071 山东青岛，中科院海洋所
100037 北京，首都师范大学化学院(通讯作者)