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【摘要】 肿瘤的生长和转移都离不开新生血管的生成，肿瘤抑素是一种来源于基膜胶原IV（Col IV）的蛋白片断，具有抗肿瘤新生血管生成和抑制肿瘤细胞增殖的双重活性，能特异性地抑制肿瘤血管内皮细胞蛋白的合成。对其进一步的研究证实肿瘤抑素是一种内源性的病理血管生成的抑制剂，具有潜在的药用价值。本文主要概述肿瘤抑素的来源、结构和分布,活性研究,作用机制及其与基质金属蛋白酶（MMP）的关系等最新研究进展和应用前景。
【关键词】 肿瘤抑素；肿瘤新生血管生成抑制剂；内皮细胞；αvβ3整合素
Advances of an inhibitor of tumor angiogenesis－Tumstatin
YAN Ting-dong，ZHAO Qi-ren.
Tianjin Key Laboratory of Molecular Nuclear Medicine, Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Tianjin 300192,China
【Abstract】 Tumors cannot grow or metastasize without the recruitment of new blood vessels. Tumstatin is a C-terminal NC1 fragment of type IV collagen α3 chain that inhibits pathological angiogenesis and suppresses proliferation of endothelial cells and growth of tumors. Further studies suggest that tumstatin is an endogenous inhibitor of pathological angiogenesis. This review introduced the origin，structure and distribution of tumstatin; the biological activity of tumstatin; the mechanism of tumstatin and the relationship between tumstatin and matrix metalloproteinases; the futures of tumstatin.
【Key words】 tumstatin；inhibitor of tumor angiogensis；endothelial cell；αvβ3 integrin
新生血管生成，是指从既存的成熟血管形成新的毛细血管网络的过程，这个过程对于脊椎动物的生理发育和损伤组织的修复是必需的，同时，许多疾病的病理过程都涉及到新生血管生成，包括肿瘤生长、心血管疾病、糖尿病性视网膜病变、银屑病和风湿性关节炎等疾病［1～3］。1971年，Folkman［4］提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”的观点。迄今，大量研究表明，肿瘤及转移物的生长、维持必须有新生血管提供氧气和养料，运走代谢产生的有害物质，而且还以旁分泌形式刺激肿瘤的生长，促进肿瘤细胞进入血液循环，从而向其他组织器官浸润转移，如果能抑制新生血管的形成，肿瘤细胞将发生凋亡或坏死［5］。循此思路的研究，已有多种抑制新生血管生成的药物用于抗肿瘤的研究，有的已经进入临床研究阶段，它们通过作用于遗传上稳定，不易产生药物抗性的内皮细胞来抑制肿瘤的生长。近来发现了一些分离于组织或体液的血管生成抑制物，它们是大分子蛋白的生物活性片断，而大分子蛋白本身没有表现出抗血管生成活性［6,7］。肿瘤抑素（tumstatin）是继血管生成抑素（angiostatin）和内皮抑素（endostatin）之后，最新发现的源于人基膜Col IV的肿瘤新生血管生成的抑制因子，具有明显的抑制肿瘤新生血管生成和诱导其内皮细胞调亡的活性［8］。本文重点介绍肿瘤抑素的来源、结构、活性区分布、生物学活性及其作用机制的最新研究进展。
1 肿瘤抑素的来源、结构和分布
血管基膜（VBM）是特殊的细胞外基质薄层组织，它不仅为内皮细胞提供机械和功能上的支持，而且在新血管的萌发阶段影响内皮细胞的分化和增殖。血管基膜的组织主要依赖于Col IV组装形成的网状物。Col IV是血管基膜的主要成分，由六个独特的基因产物α1-α6来编码，并以不同或相同的α链组成三聚体，进一步形成网状结构，为其他的生物大分子提供一个蛋白质支架。Col IV的每条α链都由三部分组成，即N-端的7S域、分子中间部分的胶原域和C-端非胶原域1（NC1）。 Col IV的六条α链形成被称为前体的三股螺旋的组合。其中Col IV α3链具有组织分布的特异性，主要限于某些基膜，包括肾小球基膜、一些耳窝的基膜、眼晶状体前膜基膜、Descemet’s膜、卵巢和睾丸的基膜以及肺泡毛细血管基膜和某些组织的毛细血管基膜［9］。肿瘤抑素，分子量为28kd，由244个氨基酸组成，包括Col IV α3的NC1活性区域的232个氨基酸和中间3股螺旋区C-端的12个氨基酸［10～13］。肿瘤抑素可能是由肾、肺和睾丸的基膜释放的，这些组织富含特定的Col IV α3链。现有的假说认为生理水平的肿瘤抑素是基膜重构的一种反应产物。近来的研究表明Col IV的α1和α2链也具有抗肿瘤的活性，其对应的蛋白分子分别为 Arresten 和Canstatin［14,15］。
2 肿瘤抑素的活性研究
肿瘤抑素的活性主要是利用它的重组人源蛋白来评估的，这些蛋白表达于大肠杆菌、毕赤酵母和人胚肾293细胞，还有一些直接分离于人基膜组织。肿瘤抑素能抑制人、牛和鼠内皮细胞的增殖，也引起由VEGF和FGF激活的内皮细胞G1期的停滞。肿瘤抑素还能诱导增殖的内皮细胞调亡，这与上调的caspase3（半胱氨酸蛋白酶蛋白-3）相关［8,10］。肿瘤抑素有两个不同的活性区，分别通过不同的作用机制来抑制肿瘤的生长，其细节将在下文中作详细介绍。Maeshima等人［11］通过缺失突变的方法证明肿瘤抑素的抗肿瘤新生血管生成活性位于被称为Tum5的54－132位氨基酸。进一步研究证明，抗肿瘤新生血管生成活性区被定位于被称为T7片断的74－98位氨基酸，它具有与全长肿瘤抑素相同的抗血管生成活性［13］。全长的肿瘤抑素、Tum5和T7片断在 Matrigel plug 实验中都展示了显著的抗肿瘤新生血管生成活性。它们能显著的抑制PC-3人前列腺癌移植瘤的生长，而用内皮抑素作对照，则无显著的肿瘤生长抑制，这些实验表明在相等的摩尔剂量时，对小鼠的人前列腺癌移植瘤控制，肿瘤抑素至少较内皮抑素有效10倍。在C57BL/6小鼠786－O肾癌移植瘤模型中，肿瘤抑素及其Tum5和T7片断同样能抑制肾细胞癌的生长，诱导特定内皮细胞的调亡。为达到抑制肿瘤的生长，肿瘤抑素的药理学浓度为每天2.5～10μl/ml［8～11］。人工合成的肿瘤抑素185－203位氨基酸组成的19肽（以下简称19肽）具有特异性抑制多型核白血病细胞活化的功能，具备这种功能要求在189－191位有三联体－SNS- 氨基酸序列［16］。这种结构能特异性地与CD47/αvβ3受体结合，促进多种癌细胞粘附和趋化作用增强以及抑制肿瘤细胞的增殖。此外，该肽片断在抑制黑色素瘤细胞迁移的同时也能抑制基质金属蛋白酶－2（MMP-2）的活性，后一种作用是通过降低膜型基质金属蛋白（MT1-MMP）和β3整合素的表达量来实现的［17,18］。19肽和包括此短肽的重组蛋白片断对内皮细胞没有明显的抑制作用，但是却显示出了抗黑色素瘤细胞活性。这些结果表明肿瘤抑素具有潜在的抗肿瘤细胞的活性，但是只有当其进一步降解时才能释放出这些活性片断，或者是通过结构上的变化暴露出抗肿瘤的活性位点［6］。最近，在小鼠黑色素瘤模型中证明19肽能以构象依赖方式抑制小鼠体内肿瘤的生长，19肽的这种活性是通过下调基质金属蛋白酶（MMP）和血纤维蛋白溶酶原来实现的，抑制了肿瘤细胞的增殖，减少了细胞的浸润性。一个更短的七肽CNYYSNS(185-191)具有和19肽相同的生物学活性，3-D结构显示七肽中的YSNS(188-191)区的β－turn对生物学活性有重要作用。与此对照七肽DNYYSNS虽然和七肽CNYYSNS(185-191)只是第一个氨基酸的不同，前者为D,后者为C，但是前者在YSNS位点则不能形成β－turn，缺少抑制肿瘤活性，说明肿瘤抑素在此区的抗肿瘤活性是构型依赖性的，YSNS位点形成β－turn是其活性所必须的构型，这些肽片段通过与αvβ3整合素的作用，能有效、特异地抑制黑色素瘤细胞的增殖，进一步验证了Maeshima等人发现［19］。肿瘤抑素在两个不同的位点与受体αvβ3结合，分别是Tum5 和19肽所对应的位点［10,20］。Tum5和19肽都可与内皮细胞和黑色素瘤细胞结合，但Tum5只抑制内皮细胞的生长。与此相反，19肽却只抑制黑色素瘤细胞的增殖［10］。肿瘤抑素的两个结合位点都是以RGD(Arg-Gly-Asp)基序非依赖性方式特异性地与受体αvβ3结合的［10,20］。但是最近研究表明肿瘤抑素N端三股螺旋区中的RGD位点对于和αvβ3整合素的结合也有一定的作用。全长肿瘤抑素与αvβ3整合素的结合能力要比这两个片断与αvβ3整合素的结合能力强10倍，这说明这两个结合位点以外的结构或构型对于与整合素的结合也非常重要［21］。肿瘤抑素在功能上作为肿瘤病理新生血管生成的抑制剂，但对生理新生血管生成却没有什么影响，因为这两种新生血管在表达β整合素上有不同。Hamano等人的试验证实在增生肿瘤中的血管和毛细血管上有40％表达αvβ3整合素，在每个细胞上，可以有多达几万个αvβ3受体，然而在愈合的皮肤伤口和再生肝脏的血管中没有发现αvβ3整合素的存在，正是这些αvβ3整合素表达量的显著差异，导致了肿瘤抑素抑制新生血管生成作用的明显不同。αvβ3是肿瘤抑素的结合受体，在对β3缺陷小鼠进行的Matrigel plugs试验中，肿瘤抑素并不能抑制新生血管的生成。而 Col IV α3缺陷小鼠，即缺乏肿瘤抑素的小鼠，肿瘤抑素却能加速病理血管生成和肿瘤的生长。这些研究说明肿瘤抑素是一种特定的病理血管生成抑制剂，而对于生理性血管生成（包括发育和修复相关的血管生成）没有影响［22］。肿瘤的发生、发展可能是由促血管生成因子和抑制血管生成因子的相对水平决定的，正常生理情况下，两者处于一个平衡状态。当由原位瘤转化成恶性肿瘤时，可能涉及到新生血管形成的一个转变，因此，基因调控生理水平的内源性血管生成抑制剂可以作为一个肿瘤生长的检验点，可以用来防止原位瘤到恶性肿瘤的转化。由于这种原因，Col IV α3链缺陷小鼠Lewis瘤加速生长。当给小鼠补充重组的肿瘤抑素使其浓度达到正常生理浓度时,增加的肿瘤生长速度被停止［22］。最近研究也表明肿瘤抑素能够阻止早期糖尿病肾病中的肾小球肥大。这可能是由于糖尿肾小鼠体内的血管内皮生长因子（VEGF）、酪氨酸激酶受体1（Flk-1）和促血管生成素-2(Ang-2)的过量表达被肿瘤抑素所抑制造成的［23］。
3 肿瘤抑素的作用机制
肿瘤抑素是通过与内皮细胞表面的αvβ3整合素结合发挥作用的，整合素具有胞外基质结合能力和调节细胞行为的能力。肿瘤抑素与整合素的结合，可中断内皮细胞与基膜之间的信息联系，引起内皮细胞的凋亡、基膜降解，从而破坏内皮细胞的迁移、增生和存活。这种生物活性对于抑制新生血管生成和肿瘤细胞的生长具有重要的意义。研究表明19肽的直接抑瘤活性是通过与αvβ3结合并激活FAK和PI3K而体现的，PI3K激活细胞内腺苷酸环化酶，使cAMP水平增加，导致抑制黑色素瘤细胞的增殖和迁移［17］。而 Maeshima等人的研究证实肿瘤抑素的抑制肿瘤新生血管生成活性则与上述机制不同，而是通过特异性抑制内皮细胞蛋白的合成来实现的。肿瘤抑素与αvβ3整合素相互作用，抑制FAK、PI3K、蛋白激酶B/Akt和mTOR（mammalian target of rapamycin）的活性，从而降低了真核起始因子4E的磷酸化，在翻译的过程中，真核起始因子4E无法与4E结合蛋白1分离，导致帽子依赖型蛋白的合成受到抑制［12］。这些结果揭示了肿瘤抑素对内皮细胞的选择性机制，通过与αvβ3整合素的相互作用抑制内皮细胞蛋白的合成来实现的。现已知道内皮细胞与固定的血管内皮生长因子（VEGF）相粘联是通过αvβ3和α3β1，以及其他的αv整合素来介导的，而不是通过VEGF受体来介导的。所以肿瘤抑素通过抑制内皮细胞和固定的VEGF之间的粘连和通过与整合素αvβ3的结合，诱导了细胞的凋亡。虽然肿瘤抑素和内皮抑素都是源于基膜胶原蛋白NC1域的抗血管生成分子，但它们只有14％的氨基酸同源性，试验证明两者通过不同的信号通路。内皮抑素是通过与内皮细胞表面α5β1整合素的结合，导致抑制Ras/c-Raf/p38/ERK1分裂素激活蛋白激酶途径，而肿瘤抑素则是通过与αvβ3结合，抑制PI3K/Akt/mTOR介导的帽子依赖型翻译［12,24］。
4 肿瘤抑素和MMP
在MMP抑制剂和基因缺陷小鼠的研究中证实，MMP是一种肿瘤新生血管生长的正调控因子，MMP参与动员VBM上潜伏的VEGF, 通过消化基膜上Col I和Col IV 等物质来帮助内皮细胞（EC）进入肿瘤基质。尤其是MMP9, 能增加血管基膜上VEGF的生物活性, 成为血管生成的一个正向开关。但是，近来研究发现MMP对肿瘤血管生成也存在负调控作用。能降解基膜并生成具有抗血管生成活性的蛋白片断，例如血管抑素、内皮抑素和肿瘤抑素等。MMP-9是效率最高的从 Col IV 切割下肿瘤抑素片断的酶，MMP-2、MMP-3和MMP-13也能释放出肿瘤抑素，但是效率不如 MMP-9。与野生小鼠比较，MMP-9缺陷小鼠血液中的肿瘤抑素水平下降，正常和缺陷小鼠中的浓度分别为141+21ng/ml，350+24ng/ml，肿瘤在MMP-9缺陷小鼠中生长更快,这些结果表明MMP，尤其是MMP-9, 是肿瘤血管生成的一个负调控因子［22］。综上所述，MMP-9可能参与肿瘤血管形成的双向调控。在早期可促进血管的生成，引起基膜的破坏，内皮细胞的迁移，导致了肿瘤生长的起始；同时，通过生成肿瘤抑素等内源性蛋白片断来抑制肿瘤的生长。
5 肿瘤抑素的研究前景
肿瘤抑素以其抗肿瘤新生血管生成和抑制肿瘤细胞增殖的双重作用机制使其成为极具潜力的抗肿瘤药物。与普通的抗肿瘤药物相比，具有如下优势：（1）副作用小。肿瘤抑素属于内源性蛋白小片断，进化的证据表明，已经存在60万年，这样高度保守的分子通常不会产生毒性。（2）不会产生药物抗性。肿瘤抑素直接作用于血管内皮细胞，而不是作用于易变异的肿瘤细胞。而内皮细胞基因相对稳定，所以产生耐药的机会小。（3）高特异性。肿瘤抑素特异性的抑制肿瘤新生血管的生成，从而抑制肿瘤的生长。（4）阻断一条血管可杀死一片肿瘤组织，其结果具有放大作用，在阻断血管的同时可以阻止肿瘤的转移。肿瘤抑素在药理水平上展示出抗肿瘤新生血管生成和抑制肿瘤生长的活性，但其在生理水平的作用仍不完全清楚。将来的研究寄希望于对其机理活性的更进一步的研究。对肿瘤抑素的作用机理的研究证明其是一种类似于P53的抑癌基因，可考虑将其基因注入体内，用于体内基因治疗，使血液中的肿瘤抑素保持一定的含量，从而抑制肿瘤的生成。αvβ3是近来研究很多的一个肿瘤新生血管上较理想的靶位点［25］，由于肿瘤抑素具有与其特异的结合能力，因此用放射性同位素标记肿瘤抑素，进行肿瘤的放射性受体治疗和肿瘤的放射受体显像，发挥放射性核素和肿瘤抑素的双重作用，很可能是值得重视的研究方向。
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(编辑：李 木)
基金项目：天津市自然科学基金 （编号：043610211）
作者单位： 300192 天津，中国医学科学院 中国协和医科大学放射医学研究所，天津市分子核医学重点试验室