点击显示 收起
【摘要】 目的 构建携带p53基因增殖性腺病毒CNHK600-p53载体，研究其对肝癌细胞株抑制效应是否优于Ad-p53。方法 实验分为两组，单用CNHK600-p53组和单用Ad-p53组；采用四甲基偶氮唑盐（methylthiazolyl tetrazolium assay， MTT），观察两组对肝癌细胞株的杀伤效应。结果 单用CNHK600-p53组较单用Ad-p53组肝癌细胞株细胞抑制率高；但当细胞抑制率达到80%以上时，两组之间差异无显著性，统计分析采用率的U检验。结论 较Ad-p53相比携带p53基因的CNHK600-p53能更有效抑制肝癌细胞株，CNHK600-p53可望成为肝癌基因治疗的新方法。
【关键词】 基因；p53； 肝肿瘤； 基因疗法
The effect of new type replicating adenovirus on the treatment of hepatocarcinoma cell line
YANG Jia-he, DUAN Ji-cheng, QIAN Qi-jun,et al.
Department of Comprehensive Treatment Ⅲ，Eastern Hepatobilillary Surgery Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200438,China
【Abstract】 Objective To construct a replicating adenovirus vector CNHK600-p53 which carried the anti-tumor gene p53,then investigate its inhibition effect is better than Ad-p53 on hepatocarcinoma cell line.Methods The subject is divided into two groups:single CNHK600-p53 group and single Ad-p53 group. The methylthiazolyl tetrazolium assay （MTT）method was used to observe the killing effect of hepatocarcinoma cell line.Results The single CNHK600-p53 group’s inhibition rate is higher than single Ad-p53 group; But when inhibition rate is about to 80%, there are no difference in two groups. The data are analysed by U test.Conclusion Contrast to Ad-p53, adenovirus CNHK600-p53 is more effective in inhibition to hepatocarcinoma cell line. CNHK600-p53 may be an new gene method for hepatocarcinoma.
【Key words】 gene;p53;hepatocarcinoma;gene therapy
p53基因是重要的肿瘤抑制基因，与肿瘤的发生、发展以及预后关系密切。已证明超过50%以上的肿瘤存在p53基因的异常，且发现p53 基因的突变可能与肿瘤的耐药性密切相关［1］，因而p53基因导入成为重要的肿瘤基因治疗手段，也可能是解决肿瘤耐药性的方法之 一。本实验构建携带p53基因增殖性腺病毒CNHK600-p53载体，研究其对肝癌细胞株抑制效应是否优于Ad-p53。
1 材料与方法
1.1 材料 293细胞、腺病毒载体pUC19购自加拿大MICROBIX BIOSYSTEMS公司；腺病毒载体pClon17、腺病毒载体CNHK600、腺病毒载体ppE3本室构建；限制性内切酶、胎牛血清、DMEM和Lipofectamine2000试剂盒购自Gibco公司；Taq酶、pfu酶购自MBI公司； T4 DNA连接酶购自PROMEGA公司；琼脂糖、溴化乙锭购自GENE公司；胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒、质粒DNA制备试剂盒和病毒DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；人肝癌细胞株BEL-7402、人肝癌细胞株QGY-7703购自中国科学院上海细胞生物学研究所，人肝癌细胞株PLC/PRF5、人肝癌细胞株HepG2购自美国ATCC公司；增殖缺陷型腺病毒Ad-p53购自深圳赛百诺公司。
1.2 增殖性腺病毒载体 CNHK600-p53构建 设计引物，上游引物：5′-CCG GAA TTC GCC ATG GAG GAG CCG CAG T-3′；下游引物：5′-CGC GGA TCC TTA TCA GTC TGA GTC AGG CCC TTC TG-3′，PCR方法扩增p53基因，用胶回收试剂盒回收大小为1179 bp的DNA片段，回收片段及pUC19载体分别用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，将酶切后的p53目的基因片段与酶切后的pUC19载体连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态，挑取生长的细菌单克隆， PCR法筛选阳性克隆。抽提阳性克隆的质粒DNA，酶切鉴定并测序（TaKaRa）正确后命名为pUC19-p53，将pUC19-p53用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，pClon17载体用EcoRⅠ和NheⅠ酶切，将酶切后p53目的基因片段与酶切后的pClon17载体连接，转化DH5α大肠杆菌感受态，挑取生长的细菌单克隆，PCR法筛选阳性克隆。抽提阳性克隆的质粒DNA，PCR及酶切鉴定，鉴定正确后命名为pClon17-p53，将pClon17-p53用AgeⅠ、NotⅠ和ScaⅠ酶切，CNHK600用AgeⅠ、NotⅠ酶切，37℃水浴4h，分别电泳切胶回收2.469 kb和10.35 kb的片段，将酶切后含CMV启动子+p53基因+SV40 poly-A加尾信号的目的片段与酶切后的CNHK600载体连接，转化、挑克隆、抽提质粒，PCR及酶切鉴定。
1.3 增殖性腺病毒CNHK600-p53的包装及鉴定 利用Lipofectamine2000试剂盒，将质粒CNHK600-p53与和5型腺病毒骨架载体ppE3共转染至293细胞。转染后9～14天细胞出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，应用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取腺病毒DNA（其具体方法参见QIAGEN公司操作说明）。一组引物(见构建部分)检测p53基因的存在，另一组引物 (上游引物：5′-CTG GCC AAT ACC AAC CTT A-3′；下游引物：5′-ATA TGA GCT CAC AAT GCT TC-3′)用来排除野生型腺病毒的存在。对病毒重组体进行PCR鉴定正确者命名为CNHK600-p53，即携带p53基因的双调控增殖型腺病毒，氯化铯密度梯度离心法纯化病毒，TCID50方法测得病毒滴度1.99×1010pfu/ml，-80℃保存。
1.4 两种病毒对肝癌细胞株增殖的影响 实验分两组:（1）单用CNHK600-p53组；（2）单用Ad-p53组。取对数生长期的肝癌细胞株(BEL-7402、QGY-7703、PLC/PRF5、HepG2)接种于3板96孔细胞培养板（约1×104个细胞/孔），培养24h，待细胞贴壁生长良好后吸去培养基。CNHK600-p53组及Ad-p53组分别加入病毒100μl/孔（对于肝癌细胞株QGY-7703和HepG2，MOI分别为0.01、0.1、1、10、100、1000；对于肝癌细胞株BEL-7402，MOI为0.001、0.01、0.1、1、10、100；对于肝癌细胞株PLC/PRF5，MOI为0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10；）；加入病毒100μl/孔，每个浓度设4个复孔，置于5% CO2培养箱培养72 h，弃去培养液，加入无血清培养液100μl/孔，加MTT 10μl/孔，轻拍96孔板边缘5min，置于37℃ 5%CO2孵箱内4～6 h；加10%SDS+0.01 mol/L HCl 100 μl/孔，轻拍96孔板边缘5 min，置于37℃ 5%CO2孵箱内，过夜；酶联免疫检测仪， 测定570nm波长光密度值。以上实验均重复3 次。
1.5 统计学方法 数据以x±s表示，细胞抑制率=（对照孔D值-实验孔D值）/对照孔D值×100%，统计分析采用率的U检验分析。
2 结果
单用CNHK600-p53组及单用Ad-p53组的细胞的D值及细胞抑制率详见表1～4。
表1 CNHK600-p53或Ad-p53对PLC/PRF5细胞的D值和细胞抑制率（略）
表2 CNHK600-p53或Ad-p53对HepaG2细胞的D值和细胞抑制率（略）
表3 CNHK600-p53或Ad-p53对BEL-7402细胞的D值和细胞抑制率（略）
表4 CNHK600-p53或Ad-p53对QGY-7703细胞的D值和细胞抑制率（略）
注：*P<0.05,**P<0.01 vs Ad-p53 group
随着病毒MOI值的不断增高其杀伤肝癌细胞能力也增强；单用CNHK600-p53组较单用Ad-p53组细胞抑制率高；但当细胞抑制率达到80%以上时，两组之间差异无显著性。
3 讨论
1996年美国ONYX药物公司研究的E1B55KD缺陷的增殖型腺病毒（ONYX-015），它利用肿瘤细胞中p53基因突变而正常细胞中p53正常的差异使病毒在肿瘤细胞中特异性增殖。目前该病毒已进入Ⅲ期临床试验。但是，单用该病毒疗效甚微，有效率低于20%，所以必须与放化疗联合应用才能有效的杀伤肿瘤［2］。但ONYX-015存在着诸多不足，如在体内半衰期短，需要反复注射等。为此我们设想应用上面介绍的肿瘤特异性增殖型腺病毒携带某种对肿瘤治疗有明确疗效的抗癌基因，利用这类病毒在肿瘤细胞内特异性增殖及复制，而在正常细胞内不增殖的特点，从而使包括p53在内的抗癌基因在肿瘤细胞内特异性高效表达，这种结合病毒治疗与基因治疗优点的新型治疗方案称为基因病毒治疗法。在前期的研究中，我们实验室构建了肿瘤特异性增殖腺病毒CNHK500，体内及体外实验结果均表明CNHK500在选择性增殖和抗肿瘤疗效上明显优于ONYX-015，且在静脉大剂量用药的情况下未观测到明显的肝细胞毒性［3，4］。为了进一步降低病毒对正常细胞的毒性作用，提高安全性，我们利用正常细胞和肿瘤细胞的另一大差异—Rb基因，在CNHK500的基础上构建了CNHK600。最近国外研究发现导入野生型p53基因联合化疗或放疗，可取得较好的治疗效果［5］；p53基因的缺失或突变在肿瘤是非常常见的基因异常，p53基因突变影响肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性［6］。Ad-p53（商品名今又生）2004年在中国上市，是一种重组人p53基因的非增殖型腺病毒，该病毒对肺癌、皮肤癌、宫颈癌、胃癌、肠癌、食管癌、头颈部癌等肿瘤患者的治疗显示，32%的患者肿瘤完全消失，27%的患者肿瘤部分消失，41%的患者肿瘤停止生长，显示出良好的治疗效果。但与其他的肿瘤基因治疗一样，Ad-p53也存在转染率不高、表达不稳定、靶向性不强等问题。本实验将p53基因插入增殖型腺病毒CNHK600，构建携带p53基因的增殖性腺病毒CNHK600-p53，该病毒缺失E1A中与Rb蛋白结合的基因序列，保留使腺病毒有效逃避宿主免疫监视及有效裂解宿主细胞而释放子代病毒的E3区，用人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子及缺氧反应(HRE)启动子来分别调控腺病毒的E1A及E1B基因，从而使病毒的复制更准确地靶向肿瘤细胞，力图达到广谱、特异、安全、高效的抗癌效果。通过体外实验观察CNHK600-p53是否优于Ad-p53，我们发现CNHK600-p53对肝癌细胞的抑制效果优于Ad-p53，但当细胞抑制率达到80%以上时，两组之间差异无显著性。原因可能为CNHK600-p53为增殖型腺病毒，其在肿瘤细胞内可以特异性的增殖，p53基因的表达量成倍数级增长，同时释放出的病毒颗粒亦可杀伤肿瘤细胞；但当细胞抑制率达到80%以上时，肝癌细胞大部分死亡，影响了CNHK600-p53在肝癌细胞中的增殖有关。
【参考文献】
1 Chan KT, Luang ML. Mutant p53 expression enhances drug resistance in a hepatocellular carcinoma cell line. Cancer Chemother Pharmacol, 2004, 53: 519-526.
2 Chiocca EA, Abbed KM, Tatter S, et al. A phase I open-label, dose-escalation, multi-institutional trial of injection with an E1B-attenuated adenovirus, ONYX-015, into the peritumoral region of recurrent malignant gliomas in the adjuvant setting. Mol Ther, 2004, 10: 958-966.
3 李月敏，宋三泰，江泽飞，等. 选择性增殖腺病毒CNHK500治疗腺癌的实验研究. 中国肿瘤生物治疗杂志，2005，12：124-128.
4 张琪，彭林辉，吴红平，等. 双重调控选择增殖型腺病毒CNHK500的构建及初步研究. 中华实验外科杂志，2004，21：1366-1368.
5 El-Aneed A. Current strategies in cancer gene therapy. Europ Pharmacol, 2004, 498: 1-8.
6 Ferreira CG, Epping M, Kruyt FA, et al. Apoptosis: target of cancer therapy. Clin Cancer Res, 2002, 8: 2024-2034.
(编辑：悦 铭)
作者单位： 200438 上海，第二军医大学东方肝胆外科医院综合三科(△病毒基因治疗实验室)