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凯氏定氮法是测定蛋白质的国标方法。2%硼酸溶液是测定方法中碱化蒸馏时所使用的吸收液,用来吸收游离出的氨,然后用盐酸或硫酸标准溶液滴定,根据混合指示剂颜色变化判断终点。
1 试剂与方法
1.1 2%硼酸吸收液的配制方法 (1)将2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液混合。(2)将适量上述混合指示剂一次性加入已配制好的2%硼酸溶液中,使溶液呈蓝紫色。
1.2 2%硼酸吸收液使用方法 按照国标方法(GB5009.5—85)操作,在平行试验时,可将已滴定至终点的2%硼酸吸收液重复使用。
1.3 配制方法 配制2%硼酸吸收液时,混合指示剂加入量不宜过多,以透过试剂瓶观察蓝紫色刚好透明为宜。若溶液偏蓝,用0.1%甲基红乙醇溶液调至蓝紫色;反之若偏紫红,可用0.1%次甲基蓝乙醇溶液调至蓝紫色。
1.4 配制后的2%硼酸吸收液可行预试验 即取少量吸收液于试管中,加入1滴氨水(1+2)观察其颜色变化是否明显与正常。
1.5 反应原理 样品中的蛋白质经硫酸和催化剂消化后,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵,然后碱化蒸馏使氨游离,用2%硼酸溶液吸收生成硼酸铵。其反应为:2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O使吸收液由酸性变为碱性,混合指示剂由蓝紫色变为绿色,然后用盐酸或硫酸标准溶液滴定,使混合指示剂再由绿色返至蓝紫色即为终点。重复使用时,仍可按上述原理反应。
1.6 终点颜色 滴定终点观察颜色时,样品消化液终点与空白消化液终点应色调一致。
2 结果
一次使用2%硼酸吸收液的国标方法与重复使用2%硼酸吸收液的新方法进行对照实验,经t检验,t=0.676, P>0.05,两种使用方法差异无显著性。对照实验结果见表1。
表1 对照实验结果(略)
3 讨论
用一次性加入混合指示剂的方法配制2%硼酸吸收液,将已滴定至终点的吸收液重复使用,用于平行实验。这样可简化实验操作,尤其在进行批量样品检验时,对于2%硼酸吸收液可不必逐个滴加混合指示剂,减少50%吸收次数,节约50%用量,从而提高工作效率和经济效益。
(编辑:李 木)
作者单位: 150056 黑龙江哈尔滨,哈尔滨市疾病预防控制中心