阿托伐他汀对实验性变态反应性脑脊髓炎豚鼠模型发病的影响

　　阿托伐他汀对实验性变态反应性脑脊髓炎豚鼠模型发病的影响(pdf)

    【摘要】  目的  探讨阿托伐他汀对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的防治作用。方法  皮下注射粗制碱性髓鞘蛋白(MBP)建立EAE模型，EAE模型分为高、低剂量治疗组和对照组。治疗组造模前7天开始灌胃阿托伐他汀直至整个实验结束，对照组不用阿托伐他汀。结果  治疗组的潜伏期比对照组缩短(P＜0.01或P＜0.05)，低剂量组的潜伏期比高剂量组潜伏期长，两者具有统计学的差异(P＜0.05)；治疗组的进展期明显缩短(P＜0.01)；病情高峰期神经功能缺失评分，高剂量治疗组与对照组相比，明显降低(P＜0.01)；EAE对照组的死亡率高达50%，EAE低剂量组的死亡率为20%，EAE高剂量组无死亡，各组间差异具有显著性(P＜0.05)。结论  阿托伐他汀具有延长EAE动物发病潜伏期，缩短病情进展期，减轻中枢神经系统损害作用，降低高峰期死亡率。

　　【关键词】  EAE；HMG-CoA抑制剂

　　Effect of atorvastatin on experimental allergic encephalomyelitis in guinea pig

　　RONG Ben-bin，LI Zuo-xiao.The Affiliated Hospital，Luzhou Medical College，Sichuan 646000，China

　　【Abstract】  Objective  To explore the prophylaxis and treatment effects of atorvastatin on experimental allergic encephalomyelitis(EAE).Methods  The experimental EAE mould was established by subcutaneous administrating coarse myelin basic protein (CMBP) in Guinea pig，and all the subjects were divided into two groups as control group and treatment group;The treatment group mice were divided into low dose group and high dose group perfused with atorvastatin transgastricly seven days before the mould，and the control group didn’t use atorvastatin.Results  The delitescence of the treatment group was significantly shorter than the control group(P＜0.001)，and the delitescence of the low dose group was shorter than the high dose group(P＜0.05).The progression of the treatment group was significantly shorter than the control group(P＜0.01).Comparing to the control group，the maximal disease score was significantly decline in the high dose group(P＜0.01).Conclusion  Atorvastatin could postpone the delitescence of the EAE mould animal，prevent the progression of the disease，alleviate the damage of the central nervous system and reduce mortality rate at fastigium.

　　【Key words】  EAE;HMG-CoA inhibitor

　　EAE是实验动物发生的一种局限在神经系统内的迟发型超敏型自身免疫性疾病［１］，具有与人类多发性硬化、急性播散性脑脊髓炎相同的免疫及病理特征［２］，是人类中枢系统脱髓鞘病的动物模型。他汀类药物是3-羟甲基-戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，目前研究在发挥降脂同时发挥免疫调节作用。本实验探讨他汀类药物是否对EAE动物具有保护作用，现报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物 

　　使用大白鼠5只，300～３５０g；豚鼠，共30只，雌雄各半，体重250～３５０g，由泸州医学院实验动物科提供，均为1级合格动物，合格证号：川医动字第2401115。

　　1.2  药品和试剂 

　　福氏完全佐剂(Freund’s adjuvant complete，含卡介苗10mg/ml)Sigma公司产品；阿托伐他汀钙片(Atorvastatin Calcium Tablets)，北京红惠生物制药股份有限公司生产。

　　1.3  方法

　　1.3.1  粗制MBP抗原制备 

　　将大白鼠处死后，迅速取出脊髓，用匀浆器制成50%的匀浆，与等量福氏完全佐剂(卡介苗10mg/ml)混合，用注射器抽打至油包水乳剂。

　　1.3.2  EAE模型的建立与分组 

　　用粗制碱性髓鞘蛋白(MBP)抗原注入豚鼠后足掌皮下，每侧0.2ml造EAE模型。EAE模型分为高、低剂量治疗组和对照组。EAE模型治疗组20只：高剂量组10只，造模前1周开始灌胃阿托伐他汀4mg/(kg·d)直至整个实验结束；低剂量组10只，造模前1周开始灌胃阿托伐他汀1mg/(kg·d)直至整个实验结束。EAE模型对照组10只，不服阿托伐他汀。

　　1.3.3  用药方法 

　　为保证等容积给药，将阿托伐他汀钙配成0.4mg/ml、0.1mg/ml两种浓度的溶液，阿托伐他汀大、小剂量分别相当于人用量的10、2.5倍剂量，高剂量组4mg/kg，用0.4mg/ml浓度的药；低剂量组0.05mg/kg，用0.1mg/ml浓度的药，给药容积均为1ml/100g。

　　1.3.4  豚鼠EAE模型的症状评分

　　0分：无明显异常；1分：后肢无力；2分：后肢麻痹；3分：后肢麻痹伴前肢无力；4分：四肢瘫痪或死亡。

　　1.3.5  实验终止 

　　EAE模型组及EAE模型治疗组四肢瘫痪、死亡或连续3天症状评分无加重时作为EAE发病高峰，处死动物；未发病动物观察2个月处死。假手术组与正常对照组3周后处死动物。

　　1.4  统计学分析 

　　计量资料以均数加减标准差（x±s）表示，进行单因素方差分析，组间两两比较用Bonferroni法进行检验；计数资料采用Fisher’s exact test检验。变量间相互关系采用直线相关分析。统计学处理由SPSS 11.5软件完成。P＜0.05为差异有显著性，检验水准α＝0.05。

　　2  结果

　　2.1  临床症状 

　　EAE模型组及EAE模型治疗组所用的豚鼠均发病，潜伏期14～３０天不等。患病豚鼠表现为体重下降，肢体无力，自伤后肢，重者四肢瘫痪、抽搐、死亡。取脑组织及脊髓作病理检测，HE染色，光镜下可见血管周围炎性细胞浸润及脱髓鞘改变，证实EAE模型成功。

　　2.2  阿托伐他汀对EAE模型发病的影响 

　　见表1。表1  阿托伐他汀对EAE模型发病的潜伏期、进展期、高峰期症状评分影响  (略) 注：与对照组比较，t=3.71，P＜0.01；Δ与对照组比较，t=4.95，P＜0.05；＃与低剂量组比较，t=3.03，P＜0.05

　　结果表明：治疗组的潜伏期比EAE模型组短(P＜0.01或P＜0.05)，低剂量组的潜伏期比高剂量组潜伏期长，两者具有统计学的差异(P＜0.05)，提示阿托伐他汀能延长EAE动物发病潜伏期，抑制EAE动物模型发病能力大小与阿托伐他汀剂量有关；高低剂量组进展期差异无显著性，但与EAE模型相比，治疗组的进展期明显缩短(P＜0.01)；病情高峰期神经功能缺失评分，与EAE模型相比，高剂量治疗组明显降低(P＜0.01)，但低剂量组与EAE模型相比差异无显著性。

　　2.3  阿托伐他汀对EAE豚鼠模型发病高峰期死亡率 

　　见表2。表2  高、低剂量治疗组和模型对照组发病高峰期死亡情况比较（略）注：Fisher’s exact test，P＜0.05
   
　　由表2可以看出：EAE对照组的死亡率达50%，阿托伐他汀治疗组的死亡率为20%，高剂量治疗组的EAE无死亡，各组间死亡率的差异统计学上具有显著性意义(P＜0.05)。提示阿托伐他汀能明显降低发病动物高峰期的死亡率。

　　3  讨论

　　EAE具有多发性硬化(MS)相同的病理和免疫特征。目前认为MS发病是机体免疫调节紊乱造成Ts细胞数量减少和功能缺陷，Th细胞功能相对亢进，最终导致B细胞过度活化而产生以抗髓鞘碱性蛋白抗体为主的自身免疫性疾病［３］。Th亚群即Th1／Th2分布及功能异常与MS的免疫发病密切相关。Th1分泌的IFN-γ、TNF-α、IL-2等，促进MS的发病，而Th2分泌IL4、IL-6、IL10等，抑制MS的发病［４］。

　　他汀类药物包括阿托伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀等，都是3-羟甲基-戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂。目前资料证实，该类药具有抗炎和免疫调节作用。Nath N［５］等初步发现洛伐他汀调节Th1分化，降低血清IFN-γ、TNF-α水平，增强Th2细胞分泌活性，使血清IL-4、IL-5、IL-10增高，可缩短被动免疫诱发的SJL/J鼠EAE模型的病程并减轻EAE模型的病情严重程度。Timothy Vollmer［６］等对30例复发-缓解型多发性硬化患者服用斯伐他汀6个月，头颅MRI证实脑内多发性硬化病灶数量减少44%，总病区大小减少41%，认为与该药抑制多发性硬化的炎性成分有关。

　　本组实验结果表明，阿托伐他汀延长豚鼠EAE模型发病潜伏期，显著减少了神经系统损害的病程进展期(P＜0.01)，降低了高峰期神经功能缺失评分和死亡率，提示阿托伐他汀对EAE动物模型发病有保护作用。同时高剂量组EAE发病潜伏期、最大神经功能评分和发病高峰期死亡率均较低剂量组差异有显著性，提示阿托伐他汀对EAE模型发病的保护作用呈剂量依赖关系。

　　【参考文献】

　　1  袁锦楣.临床神经免疫学.北京：科学技术出版社，1992，123.

　　2  Render MP.The pathophysiology of acute experimental allergic encephalomyelitis in the rabbit.Brain，1984，107:699.

　　3  Waksman BH.Current trends in multiple sclerosis research.Immunol Today，1981，1:87-89.

　　4  Buntinx M，Ameloot M，Steels P，et al.Interferon-gamma-induced calcium influx in T lymphocytes of multiple sclerosis and rheumatoid arthritis patients: a complementary mechanism for T cell activation.J Neuroimmunol，2002，124(1-2):70-82.

　　5  Nath N，Giri S，Prasid R，et al.Potential targets of 3-hydroxy-3-methylgluaryl coenzyme A reductase inhibitor for multiple sclerosis therapy.J Immunol，2004，172(2):1273-1286.

　　6  Timothy V，Lyndon k，Vnlerie D，et al.Oral simvastain treatment in relapsing-remitting multiple sclerosis.Lancet，2004，363:1607-1608.

　　作者单位： 646000 四川泸州，泸州医学院附属医院神经内科