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【摘要】 目的 对梅毒螺旋体抗原表位进一步优化，以满足梅毒检测试剂的需要。 方法 用信息生物学软件对梅毒螺旋体TpN47抗原表位进行分析，在我们以前研究工作的基础上，延伸其长度，用化学合成法获得目的基因，插入到pBVIL1载体中，构建pBVIL1/TpN47表达质粒。将新获得的TpN47基因与本研究室保存的TpN15、TpN17、TpN44.5基因片段相连接，进行嵌合表达，经纯化后用双抗原夹心法测其活性。 结果 经改进的重组梅毒螺旋体多表位嵌合抗原，用于检测国家新一代的参考品，其阳性及阴性符合率均为100%，4份灵敏度符合参考品的要求。 结论 所构建的pBVIL1/TpN15＋TpN44.5＋TpN17＋TpN47嵌合质粒，在E.coli中获得了高效表达，经测定，此抗原可满足新一代梅毒检测试剂的需要。
【关键词】 梅毒螺旋体；TpN47；嵌合抗原；参考品
Improvement based on recombinant multi-epitope chimeric antigen Treponema pallidum and its application
SONG Xiao-gou，WANG guo-hua，CHEN Kun，et al.Institute of Basic Medical Sciences, AMMS, Beijing 100850,China
【Abstract】 Objective In order to detect Kit antibodies of syphilis，the epitope chimeric antigen of Treponema pallidum were optimized further. Methods Treponema pallidum TpN47 antigen epitope were analyzed by information biology software,to extend its length, then linked with TpN15, TpN17, TpN44.5 antigens gene fragment. The recombinant Treponema pallidum multi-epitope chimeric antigens was expressed in E.coli. The Activity of multi-epitope chimeric antigens were detected by sandwich antigen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Improvement based on recombinant multi-epitope chimeric antigen Treponema pallidum antigens were used newly panel of antibodies syphilis, results of detection were both positive and negative coincidence ratio of 100%, 4 serial sensitivity consistent with panel. Conclusion Recombinant of multi-epitope chimeric antigen of Treponema pallidum was highly expressed in E.coli. Satisfy requirememnt for new panel of syphanaly antibodies.
【Key words】 Treponema pallidum；multi-epitope chimeric antigen; TpN47；panel
目前，临床上对梅毒螺旋体感染的检测，常用的方法是血清学检测，如酶联免疫吸附测定（ELISA）［1］法等，此方法所用抗原绝大部分为重组蛋白。在以前的研究［2］中，我们分别选择了TpN15、 TpN17、 TpN44.5和 TpN47的优势抗原表位，进行了克隆和表达，并将此四组基因连接，在E.coli中进行了嵌合表达，此抗原在当时梅毒感染血清学检测中起了重要作用，但随着新一代参考品（panel）的起用，我们发现不能完全满足检测试剂的需要，其原因可能是TpN47基因片段过短所致，因当时为了最大限度缩短基因长度，以降低非特异性反应，仅选用了24个氨基(78～101)。我们再次以梅毒全基因组序列［3］为基础，用Biosun分子生物学软件［4］重新对抗原表位进行了全面系统地分析，增加TpN47基因长度，即选用400个氨基酸（1～400），这样可能会提高抗原的覆盖面。此片段经与TpN15、 TpN17、 TpN44.5基因片段相连接，进行嵌合克隆表达纯化后采用双抗原夹心法对梅毒参考品进行测定，其结果符合要求。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒 原核融合表达载体pBVIL1、pBVIL1/ TpN15、pBVIL1/ TpN17、pBVIL1/ TpN44.5表达质粒由本室构建并保存；E.coli HB101，由本室保存。
1.1.2 工具酶和试剂 DNA 限制内切酶、PCR产物回收试剂盒、Promega公司生产的 T4 DNA 连接酶及T4 DNA 聚合酶购自博大泰克生物技术公司；氨苄西林用于配制LB培养基的胰化蛋白胨（bacto-tryptone）及酵母提取物(bacto-yeast)购自本院条件处。
1.1.3 引物、序列测定 由奥科生物技术有限公司合成，三博远志公司测序。
1.1.4 梅毒参考品（panel） 中国药品生物制品检定所提供。
1.2 方法
1.2.1 TpN47抗原表位的选择 先从网上Gene-Bank中获得TpN47蛋白的氨基酸全序列，用 Biosun分子生物学软件对其抗原表位进行分析，选取抗原性较强部分。
1.2.2 TpN47基因的合成方法 根据所选择的TpN47抗原表位的氨基酸序列，按大肠杆菌的优势密码子，推断出编码抗原表位的基因序列。设计多条有部分重叠序列的基因片段，从中间向两端逐步延伸合成。设计时，如发现基因中有与Xho 1、XbaI 1及Spe 1相同的酶切位点,要作适当调整。
1.2.3 PCR扩增、酶切、连接、转化及诱导表达等 参照［美］Sambroob,J.等箸，黄培堂等译《分子克隆实验实验指南》第三版有关章节进行。具体扩增条件为 95℃ 1 min, 55℃ 1min， 72℃ 1.30min， 扩增30个循环后，再72℃延伸7min。
1.2.4 纯化 从表达菌中提取包涵体,并用溶解液 (25mM TE、1%β－巯基乙醇, 8M脲pH8.5)将其溶解, 然后以SP-Sepharose FF 或 Q-Sepharose FF 进行离子交换层析, 上样后以平衡缓冲液（25mM TE 、6M脲、0.1%β－巯基乙醇、 pH8.5）洗至基线, 再用不同浓度的NaCl (用平衡缓冲液配制)洗脱。SDS-PAGE 鉴定各抗原蛋白所在的洗脱峰。将收集的洗脱峰用 sephadex G-50 凝胶过滤（缓冲液：25mM TE， 0.1%SDS pH8.5）, 收集第一峰。
1.2.5 抗原活性鉴定 用长臂生物素将纯化后的重组梅毒多表位嵌合抗原一部分进行标记，另一部分包被酶联测定板，以双抗原夹心法，对已知梅毒阴阳性血清进行测定，评价抗原的反应活性。
2 结果
2.1 TpN47抗原表位的的选择 用 Biosun分子生物学软件对TpN47抗原表位进行分析，如图1所示，选择峰值较高部分，即1～400氨基酸，作为抗原序列。 图1 Biosun分子生物学软件对TpN47抗原表位分析图 2.2 TpN47抗原表位基因的设计及获取 根据以上的氨基酸序列，用E.coli的优势密码子及基因合成方法, 设计多条有部分重叠序列的引物，在基因前端加入酶切位点Xho 1及连接臂GGTGGTGGATCT，后端引入Xba 1,为了基因片段的连接，设计了含有Spe 1 酶切位点的通用引物ACTAGTGGTGGTGGATCT。通过PCR 逐步扩增延伸法，获得了一条含1224bp 的基因序列（图2）。
2.3 pBVIL1/ TpN47表位抗原表达质粒的构建 如图3 所示，将上述获得的目的基因片段，用XhoI 和 XbaI双酶切后同，插入表达载体pBVIL1中，即获得了表达质粒pBVIL1/ TpN47，经基因序列测定，目的基因插入正确。将此质粒转化于HB101 受体菌中，42℃ 诱导后可表达目的蛋白，经SDS-PAGE鉴定，有一60kD的表达区带，这和理论值相符合（图5）。
2.4 pBVIL1/ TpN15＋TpN44.5＋TpN17＋TpN47嵌合抗原的表达 在各表位抗原表达质粒中，均含有通用连接臂，所以可按图4 方法进行连接。先将pBVIL1/ TpN44.5质粒作为模板，用含有Spe I及含有BamH I 的引物扩增出TpN44.5和部分IL-1的基因片段，插入酶切后的pBVIL1/ TpN15中，获得含有TpN15和TpN44.5两个基因的表达质粒。由于新质粒中，TpN15和TpN44.5基因间的连接是由 互补酶Xba I 和Spe I之间的相连，连接后酶切位点消失，因此，新质粒又可成为新的载体，继续与TpN17和TpN47以同样的方法连接，这样最终获得pBVIL1/ TpN15＋ TpN44.5＋TpN17＋TpN47表达质粒，经转化、诱导后，也得到了高效表达（图5），其分子为 71kD。
2.5 抗原纯化 TpN15＋TpN44.5＋TpN17＋TpN47嵌合抗原均以包涵体方式表达，所以首先从菌体中提取包涵体，溶解后经离子交换及凝胶过滤等方法进行纯化，经SDS-PAGE 鉴定，其纯度约为95%（图5）。
2.6 活性测定 我们将纯化的TpN15＋TpN44.5＋TpN17＋TpN47嵌合抗原，一部分用活化长臂生物素标记，另一部分包被酶联测定板，以双抗原夹心法对梅毒参考品进行测定，结果表明（表1），10份阳性样品均为阳性，20份阴性样品无一份假阳性；4份灵敏度样品L1-L3为阳性，L4阴性，结果符合参考品要求。 表1 中国药品生物制品检定所梅毒参考品测定结果 （OD450nm） 注：TP1～TP10：参考品10份阳性样品；N1～N20：20份阴性样品；L1～L4：灵敏度样品；cutoff=0.18
3 讨论
3.1 抗原表位的选择 在梅毒抗原研究中，基因选择极为重要，如片段过长，非特异性反应增高，即出现假阳性，如片段过短，覆盖面降低，影响检出率。用Biosun分子生物学软件对TpN47全长基因扫描，结果表明，最强表位区在1～300氨基酸之间，其次是在310～400，我们选择了1～400，目的是尽可能的增加抗原的覆盖面。
3.2 各单片段抗原嵌合表达时的排列顺序 我们选用的基因顺序是TpN15＋TpN44.5＋TpN17＋TpN47，因为TpN15和TpN44.5片段很小，放在最前，以免被掩盖，TpN17分子较大且活性较高，放于中间不会受太大影响，将TpN47放在最后是为了最大限度的提高其活性。我们也曾按不同的排列顺序表达过多种抗原，但效果不够理想（结果未显示）。
3.3 各单片段混合抗原与嵌合表达抗原活性比较 我们将各单片段抗原按一定比例混合后，测其活性，结果是阳性检出率下降，其原因可能是这四种蛋白的分子量相差较大，所以对酶联板的亲和力各不相同，即包被上去的量也不同，并且，小分子蛋白易被大分子蛋白所覆盖，这样各抗原片段所表现出的活性也就不同。我们将这四种抗原基因连接后进行嵌合表达，使其成为一个分子，这样各抗原片段就会充分发挥各自的免疫学活性。
【参考文献】
1 Young H，Moyes A, Seagar L, et al. Novel recombinant-antigen enzyme immune-oassay for serological diagnosis of sphilis. J Clin Microbiol,1998,36(4):913-917.
2 宋晓国，凌世淦，张贺秋,等.重组梅毒螺旋体表位抗原及多表位嵌合抗原研究.军事医学科学院院刊, 2002,261:28,31,34.
3 Fraser CM, Norris SJ, Weinstock GM, et al. Complete cenome sequence of Treponema pallidum, the syphilis spirochete. Science,1998,281(5375):375-388.
4 李伍举, 应晓敏.BioSun: 计算机辅助分子生物学实验设计的软件系统.军事医学科学院院刊，2004,28(5): 401-404.
作者单位：100850 北京，军事医学科学院基础医学研究所
(编辑：李 木)