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【摘要】 目的 研究构建于重组真核表达载体pcDNA3-CD200上的CD200基因在COS-7细胞中的瞬时表达。方法 体外扩增并酶切鉴定pcDNA3-CD200质粒；常规方法培养COS-7细胞；用电转染基因法将pcDNA3-CD200质粒转入COS-7细胞中，用流式细胞术（FCM）检测转染细胞CD200表达。结果 转染COS-7细胞后72h，CD200基因表达阳性的细胞计数率为44.5%。结论 成功的利用电转染基因法将重组真核表达载体pcDNA3-CD200转染到COS-7细胞中，并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达，为进一步研究CD200的生物学活性以及信号传导奠定了基础。
【关键词】 CD200;COS-7细胞; 电转染; 流式细胞术
Transient expression of recombinant CD200 gene in COS-7 cells
GAO Song,HAO Bing,HOU Zhi-fu,et al. Department of Clinical Laboratory,Second Affiliated Hospital,Zhejiang University College of Medicine,Hangzhou 310009,China
【Abstract】 Objective The transient expression of CD200 gene which was constructed to the recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3-CD200 was tested. Methods pcDNA3-CD200 plasmid was amplified and tested by an enzyme cutting technique. COS-7 cell was cultured in vitro and transferred with pcDNA3-CD200 by electrotransfer media method. The expression of CD200 was detected by flow cytometry. Results After the COS-7 cell was transferred for 72 hours,the expressing rate was recorded for 44.5%. Conclusion The recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3-CD200 was transferred into COS-7 cells successfully by electrotransfer media method. After being transferred to COS-7 cells, the CD200 protein was expressed, which lays a foundation for further studying biological activity and signal transduction of CD200.
【Key words】 CD200; COS-7 cells; electro transfer; flow cytometry
CD200是Ⅰ型膜糖蛋白，为免疫球蛋白超家族的新成员，广泛表达在人类胸腺细胞、B细胞、激活的T细胞、滤泡状树突细胞、神经元及血管内皮上［1］。近年来的研究发现，CD200和其受体（CD200R）的交互作用可以下调髓样细胞的活性，从而减轻多种自身免疫性疾病症状、延长同种或异种移植物存活时间、抑制前炎症因子引起的流产、诱导免疫耐受等［2～4］。为深入探讨该基因的功能，本实验应用电转染技术，介导目的基因CD200转染到COS-7细胞中，建立该基因的瞬时表达系统，为进一步在体外研究该分子对髓样细胞的调控机制打下了实验基础。
1 材料与方法
1.1 质粒和细胞株 pcDNA3-CD200质粒由笔者构建［5］ ；COS-7细胞株由吉林大学中日联谊医院中心实验室常规培养。
1.2 试剂及仪器 DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自天津TBD公司； FITC标记的鼠抗人CD200单克隆抗体购自Santa Cruz公司；质粒提取试剂盒、限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、DL2000 Marker和λDNA HindⅢ digest Marker均购自大连Takara公司，化学试剂均为国产 分析纯。仪器：CO2培养箱系日本平泽公司生产；MT-2型倒置显微镜系日本Olympus公司生产；电转染仪系Eppendorf公 司生产；流式细胞仪(ELITE-Ⅱ)系美国Coulter生 产。
1.3 重组质粒的制备及酶切鉴定 质粒经扩增后，参照质粒提取试剂盒说明提取、纯化质粒，经EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶切鉴定，并用紫外分光光度计测定DNA含量和纯度。
1.4 电穿孔法转染COS-7细胞 基因转染设立pcDNA3-CD200重组质粒组、pcDNA3空质粒组及对照组，采用电穿孔方法转染［6］。COS-7细胞用含10% FCS的DMEM培养于100ml的细胞培养瓶，约75%长满，0.25% 胰酶加EDTA消化后离心收集细胞，用少量PBS液重悬，调整每组细胞数至1×106个/ml。分别取20μg的pcDNA3-CD200重组质粒、pcDNA3质粒加入相应的细胞悬液中混匀，各组均分别移入0.2cm 的电穿孔杯中，冰浴10min后放入电穿孔仪的正负极之间。电穿孔参数为：真核、使用脉冲的电压110V,间隔时间20ms,电阻∞，穿孔1次。电击后将穿孔杯继续冰浴5min，移入已含10% FCS的DMEM完全培养液的24孔板，37℃ 5%CO2孵箱培养。
1.5 流式细胞检测转染效果 72h后用PBS调整各组细胞数为1×106/ml，清洗2次后加入90μl PBS、10μl FITC标记的鼠抗人CD200抗体，充分混匀，避光4℃ 孵育30min后，每组用PBS重悬混匀离心弃上清，各加入500μl PBS，用30目滤网过滤，上机检测CD200的表达。
2 结果
2.1 重组质粒的酶切鉴定 重组质粒pcDNA3-CD200（6210bp）用EcoRⅠ和HindⅢ做双酶切，双酶切后有2条带，一条在5400bp，另一条在810bp处，810bp处的条带与CD200 PCR条带大小一致，见图1。
2.2 流式细胞术检测CD200的表达 pcDNA3-CD200重组质粒组、pcDNA3空质粒组及对照组CD200的表达率分别为44.5 %、1.9 %及1.0 %（图2 A、B、C）。
3 讨论
1979年，McMaster 和Williams用Ia类似的糖蛋白免疫大白鼠后，发现胸腺中有一种过度表达的糖蛋白，命名为MRC OX2［7］ ，在HLDA7（7th Workshop And Conference On Human Leukocyte Differentiation Antigens）会议上MRC OX2被正式命名为CD200。CD200分子包含2个细胞外的IgSF域，但胞浆区较短，缺乏能与信号蛋白结合的入坞位点。CD200的受体(CD200R)也包含2个细胞外的IgSF域,它的细胞质区域很大 ,含有酪氨酸残基，能够被磷酸化,具有向细胞内转导信号的能力。CD200分子的活结构决定在其细胞外区域需要与其受体CD200R结合后才能传导信号，发挥其生物学功能。
本研究前期工作已经成功的克隆了CD200基因，并构建成真核表达质粒pcDNA3-CD200［8］，pcDNA3是一种真核表达载体，其5’端含CMV早期启动子与增强子，复制启始位置带有SV40启动子，3’端有polyA尾，能将克隆至其中的目的片段高效表达。COS-7是来源于非洲绿猴肾成纤维细胞并经SV40病毒基因转化的细胞系，能组成型地表达SV40大T抗原，使得任何复制起始位置带有SV40的转染质粒能够以很高的拷贝数进行复制。作为一种真核瞬时表达系统，COS-7是研究蛋白质结构与功能的有利工具。目前，已有多种基因转移方法可将目的基因导入受体细胞，本实验选择电转染方法，用高于某一个域值的外加瞬间脉冲电场作用于受体细胞，使细胞膜暂时性的吸收外界环境中的DNA分子，与其他转染方法相比，几乎没有生物或化学副作用，并且效率高，重复性强，快捷简便。为进一步研究CD200分子的活性以及信号传导和生物学功能，本研究选择pcDNA3为真核表达载体，利用电转染的方法，成功地将CD200转染入COS-7细胞后，表达的产物能够被抗CD200受体识别，提示其具有生物学活性，为进一步开展基因治疗和研制此类基因重组蛋白药物奠定了实验基础。
【参考文献】
1 Wright,GJ. Puklavec, MJ. Willis AC. et al. Lymphoid/neuronal cell surface OX2 glycoprotein recognizes novel receptor on macrophages implicated in the control their function. J Immunity, 2000,(13):233-242.
2 Gorczynski R M, Chen Z.et al.Increased expression of the novel molecule OX-2 is involved in prolong ation of murine renal allograft survival. Transplantation, 1998,65(8):1106-1114.
3 Clark, DA.Yu, G.levy, GA.et al. Procoagulants in fetus rejection: the role of the OX-2 (CD200) tolerance signal. J Semin Immunol, 2001,13(4):255-263.
4 Barclay AN, Wright GJ,Brooke G.et al.CD200 and membrane protein interactions in the control of myeloid cells. Trends Immunol, 2002,23(6): 258-290.
5 侯治富，高嵩，郑永晨,等.人CD200基因克隆及pcDNA3-CD200表达质粒构建.吉林大学学报（医学版），2005，31(2):186-189.
6 Tekie W, Astumian RD , Chock PB,et al. Selective and asymmetric molecular transport across electroporated cell membranes. Proc Natl Acad Sci USA , 1994， 91（24）: 11512-11516.
7 McMaster WR, Williams AF.Identification of Ia glycoproteins in rat thymus and purification from rat spleen. Eur J Immunlo, 1979， 91(9):426-433.
8 Jon A Wolff,Robert W Malone,Phillip Williams,et al.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo,Science .New Series,1990,247(4949):1465-1468.
作者单位： 1 310033 浙江杭州，浙江大学附属第二医院检验科
2 310003 浙江杭州，浙江大学医学院附属第一医院 卫生部多器官联合移植研究重点实验室
3 130033 吉林长春，吉林大学中日联谊医院中心实验室
(编辑：宋 冰)