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小鼠趋化因子CXCL10真核表达载体的构建

来源:中华医学研究杂志
摘要:小鼠趋化因子CXCL10真核表达载体的构建(pdf)【摘要】应用RT-PCR方法,从小鼠脾脏T细胞的mRNA中,扩增获得编码小鼠趋化因子CXCL10的cDNA,并加上人单核细胞趋化蛋白1的信号肽基因,将其克隆到Pucm-T载体,经酶切及测序鉴定,进而构建CXCL10重组真核表达载体。采用脂质体法体外转染COS-7真核细胞,经Westernblot和趋化......

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     小鼠趋化因子CXCL10真核表达载体的构建 (pdf) 

    【摘要】    应用RT-PCR方法,从小鼠脾脏T细胞的mRNA中,扩增获得编码小鼠趋化因子CXCL10的cDNA,并加上人单核细胞趋化蛋白1的信号肽基因,将其克隆到Pucm-T载体,经酶切及测序鉴定,进而构建CXCL10重组真核表达载体。采用脂质体法体外转染COS-7真核细胞,经Western blot和趋化指数检测,转染细胞能够表达CXCL10蛋白,其上清对淋巴细胞具有趋化作用。CXCL10的真核表达载体构建成功,为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用奠定了基础。

    【关键词】  CXCL10;基因克隆;真核表达载体

       Gene cloning and eukaryotic expression vector construction of murine CXCL10

    LI Bo, LI Qing, ZHAO Qing-li,et al.Department of Urology, Qianfoshan Hospital of Shandong Province, Jinan,Shandong  250014, China

    【Abstract】   The cDNA fragment encoding the murine CXCL10 was obtained from mRNA of mouse T cells by using reversal transcript-polymerase chain reaction (RT-PCR)and contained a signal peptide derived from the human monocyte chemoattractant protein 1, then it was cloned into the Pucm-T vector. By partial nucleotide sequencing, the cDNA was consistent with the reported mCXCL10 cDNA in the gene bank, and then was inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). The recombinant plasmid was transfected into COS-7cell line by DOTAP liposome. The expression of the target molecule was assayed by Western blot and chemotaxis assay.It was found that the cells transfected with plasmid vector could express mCXCL10 protein and it’s culture supernatants could attract T cells markedly. The successful construction of mCXCL10 eukaryotic expression vector lays the foundation for it’s further researching in treatment of tumor.

    【Key words】   CXCL10; gene cloning; eukaryotic expression vector

    趋化因子CXCL10 (IFN-γ inducible protein-10, IP-10),属于CXC家族的非ELR趋化因子,主要由活化的单核及巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生。CXCL10的受体CXCR3,属于具有7个跨膜区的G蛋白偶联受体,由活化的T细胞等表达,CXCL10与其结合后发挥趋化作用,能够诱导活化的T细胞等趋化。另外,CXCL10还能够抑制肿瘤血管生成[1~3]。基于CXCL10的多种生物学效应,国外已开展CXCL10在肿瘤和感染性疾病等方面的应用研究。本实验旨在构建小鼠CXCL10真核表达质粒,探讨其在真核细胞中的表达,为进一步研究CXCL10的生物学活性及肿瘤的基因治疗奠定基础。

    1  材料与方法

    1.1  载体、菌株及主要试剂  大肠杆菌DH5α、Pucm-T载体和真核表达载体pcDNA3.1(+)原购自Invitrogen公司。COS-7细胞购自中科院上海细胞生物所。RT-PCR试剂盒、限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ购自Promega公司。T4DNA连接酶和TaqDNA 聚合酶购自Promega公司。DNA片段回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自华美公司。鼠重组CXCL10细胞因子和兔抗鼠CXCL10多克隆 抗体为PeproTech公司产品,抗兔IgG-HRP为Santa Cruz公司产品。DOTAP脂质体转染试剂盒购自Roche公司。尼龙毛为日本和光纯药工业株式会社产品。引物合成及测序由上海申能博彩公司完成。

    1.2   CXCL10真核表达载体构建  根据Genebank小鼠CXCL10基因序列(Access AF227743)及相关文献[3~5]设计引物,为在CXCL10 cDNA加上信号肽基因,设计PCR引物时5’端包含了人单核细胞趋化蛋白1的信号肽序列,由于信号肽基因较长,采用两步PCR法。常规提取小鼠脾脏细胞总RNA,按照反转录试剂盒操作要求完成RT反应合成cDNA第1链后,PCR扩增小鼠CXCL10基因,上游引物5’-CCG GAA GCC TCC CCA TCA GCA CC-3’,下游引物5’-TGT GTG CGT GGC TTC TCT CCA-3’(342bp),反应条件为94℃预变性4 min,94℃45s、57℃45s、72℃45s,30个循环后,72℃延伸 10 min。然后以PCR产物为模板,进行巢式PCR的2次扩增,上游引物5’-ATG AAC CCA AGT GCT GCC GTC A-3’,下游引物5’-TTA AGG AGC CCT TTT AGA CCT-3’(297bp),反应条件同上。电泳回收条带,采用两步PCR法在5’端加上一个69bp的信号肽基因。5’端引物 有两条,第一条5’-CTC TTC ATC TCC GGC TCC GCC TTT TCT AGG GGT ATG AAC CCA AGT GCT GCC GTC ATT-3’,第二条5’-TCA CAA GCT TAT GAA GTG GGT AAC CTT TCT CCT CCT CCT CTT CAT CTC CGG CTC CGC CT-3’;3’端引物5’-ATC GAA TTC TTA AGG AGC CCT TTT AGA CCT T-3’,反应条件同上。经T4 DNA连接酶将目的基因连接Pucm-T载体,转化DH5α感受态菌。经蓝白斑筛选,酶切及测序鉴定正确后,酶切插入载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点。由于扩增片段两端设计的酶切位点为EcoRⅠ和HindⅢ,而片段本身也含有一个HindⅢ位点,因此采用部分酶切,先加入EcoRⅠ酶切3 h,再加入HindⅢ酶切5 min或10 min,电泳回收正确片段,与经同样酶切的pcDNA3.1 (+)连接。将连接产物酶切鉴定并反向测序,确定载体构建准确。

    1.3  体外转染实验

    1.3.1   细胞转染  参考Min WP[6]等的方法,将C XCL10表达载体(2μg)和DOTAP脂质体(8 μl)加入100μl Opti-MEM无血清培养液中混匀,室温放置45 min后,加入800μl Opti-Mem无血清培养液,使终体积为1ml。缓慢加入已接种COS-7细胞的六孔培养板,边加边摇动,37℃、5% CO2 培养4 h后弃混合液,加入完全培养液继续培养。另设转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞和未转染细胞作对照组。

    1.3.2   Western blot检测蛋白的表达  细胞培养48 h后,以甲醇-氯仿法沉淀培养液上清中蛋白。以2×SDS上样缓冲液裂解细胞,将蛋白沸水变性5 min后垂直电泳。用半干式转移法将蛋白转移到PVDF膜上,脱脂牛奶封闭,加兔抗鼠CXCL10多克隆抗体(1:1000),4℃过夜,TTBS洗3遍,再用HRP标记的抗兔二抗(1:1000)室温下孵育1.5 h,TTBS洗3遍,DBA显色。

    1.3.3  转染细胞表达CXCL10的趋化活性检测  细胞上清参考Xia等[7]的方法测定趋化指数。分离小鼠脾细胞,尼龙毛柱分离T细胞,调整细胞浓度为2×106/ml,趋化池下层的复孔加入各组细胞上清或鼠重组CXCL10细胞因子,上层加入40μl的淋巴细胞悬液,37℃、5% CO2 培养3 h,显微镜下计数5个高倍视野,趋化指数=实验孔中迁移的细胞数/对照孔中迁移的细胞数,趋化指数>2认为对淋巴细胞有趋化作用。

    2  结果

    2.1   CXCL10真核表达载体构建  脾脏细胞总RNA经逆转录巢式PCR二次扩增后,琼脂糖凝胶电泳可见一条约300bp条带(图1)。两步PCR反应后电泳,第二次PCR产物含信号肽序列,比第一次PCR略长,约370bp(图2)。将扩增片段与T载体连接、转化后,酶切及测序鉴定正确。由于扩增片段两端的酶切位点为EcoRⅠ和HindⅢ,而片段本身也含有一个HindⅢ位点,且T载体本身也有这两个酶切位点,酶切后片段较多,但仍可回收正确的目的片段(图3)。与经同样酶切的pcDNA3.1(+)连接后反向测序鉴定,表明CXCL10基因加上了人单核细胞趋化蛋白1的信号肽序列,有EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点,且mCXCL10基因序列与Genebank所示一致,说明所构建的真核表达载体正确。

    2.2  转染细胞表达CXCL10蛋白的检测  采用Western blot分别检测转染CXCL10表达载体的细胞及其培养上清中CXCL10的表达,均可检测到CXCL10蛋白;而转染空载体组和未转染组细胞均未能检测到CXCL10存在(图4)。

    2.3  CXCL10趋化功能检测  转染CXCL10表达载体细胞上清的趋化指数为2.7±0.3,对淋巴细胞有明显趋化作用;而两对照组细胞上清的趋化指数均小于2,对淋巴细胞无趋化作用。

    3  讨论

    CXCL10基因由IFN-γ诱导,其生物学功能包括抑制造血细胞集落形成,趋化单核细胞、活化的T细胞和NK细胞,刺激T细胞粘附内皮细胞以及NK细胞介导的细胞融解,抑制血管生成等[8]。研究显示免疫系统能够排斥稳定转染并表达CXCL10的肿瘤细胞[9],CXCL10还能够抑制肿瘤血管生成[8]。因此CXCL10的抗肿瘤作用是通过趋化T细胞的免疫反应和抑制血管生成的非免疫反应完成的。另有文献报道,CXCL10与细胞因子IL-12或IL-18联合应用,可以明显增强抗肿瘤作用[2]。

    为了使转染CXCL10基因的细胞能更有效的将CXCL10蛋白分泌到细胞外,我们用PCR法在目的基因片段上添加了单核细胞趋化蛋白1的信号肽基因,该信号肽基因具有引物设计方便,PCR反应简单,信号肽跨膜转运功能强的特点[4,5]。测序结果表明,目的基因已包含了单核细胞趋化蛋白1的信号肽序列,有起始密码子ATG和终止密码子TAA,序列结果正确,证明信号肽基因已加在CXCL10cDNA上。Western blot和趋化功能检测表明转染成功,分泌的因子具有功能活性,对淋巴细胞具有明显趋化作用,说明该信号肽具有将CXCL10跨膜转移到细胞外的功能。本实验为进一步深入研究CXCL10对淋巴细胞的趋化活性及其在抗肿瘤治疗中的作用提供了可能。

    【参考文献】

    1  Dufour JH, Dziejman M, Liu MT,et al. IFN-gamma-inducible protein 10 (CXCL10;CXCL10)-deficient mice reveal a role for CXCL10 in effector T cell generation and trafficking. J Immunol,2002,168:3195.

    2   Liu Y, Huang H, Saxena A,et al. Intratumoral coinjection of two adenoviral vectors expressing functional interleukin-18 and inducible protein-10, respectively, synergizes to facilitate regression of established tumors. Cancer Gene Ther,2002,9:533.

    3  Giese NA, Raykov Z, DeMartino L,et al. Suppression of metastatic hemangiosarcoma by a parvovirus MVMp vector transducing the CXCL10 chemokine into immunocompetent mice. Cancer Gene Ther,2002, 9:432.

    4  Chen QR, Kumar D, Stass SA,et al. Liposomes complexed to plasmids encoding angiostatin and endostatin inhibit breast cancer in nude mice. Cancer Res,1999, 59:3308.

    5  Sargent TD, Yang M, Bonner J.Nucleotide sequence of cloned rat serum albumin messenger RNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1981,78: 243.

    6  Min WP, Gorczynski R, Huang XY,et al. Dendritic cells genetically engineered to express Fas ligand induce donor-specific hyporesponsiveness and prolong allograft survival. J Immunol,2000, 164:161.

    7  Xia DJ, Zhang WP, Zheng S,et al. Lymphotactin cotransfection enhances the therapeutic efficacy of dendritic cells genetically modified with melanoma antigen gp100. Gene Ther,2002, 9:592.

    8  Sgadari C, Angiolillo AL, Cherney BW,et al. Interferon-inducible protein-10 identified as a mediator of tumor necrosis in vivo.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:13791.

    9  Luster AD, Leder P. CXCL10, a C-X-C chemokine, elicits a potent thymus-dependent antitumor response in vivo. J Exp Med, 1993,178:1057.

    (*基金项目:2005年山东省医药卫生科研项目(编号:2005HW124)

    作者单位: 1 250014 山东济南,山东省千佛山医院泌尿外科

    2 200032 上海,复旦大学上海医学院解剖组胚系

    3 200433 上海,复旦大学遗传研究所

    (编辑:悦  铭)

作者: 李博,李青,赵庆利,魏学斌 ,张新华 ,吴超群,钟翠
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