酶放大镧系元素发光时间分辨荧光分析中 关键试剂的研究

     酶放大镧系元素发光时间分辨荧光分析中 关键试剂的研究 (pdf) 

    【摘要】  目的  研制成镧系元素发光时间分辨荧光分析中的关键试剂。 方法  用过碘酸钠法研制成辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，用戊二醛二步法研制成碱性磷酸酶标记链霉亲和素和用化学合成法研制成5-氟水杨酸磷酸酯等关键试剂。结果  HRP标记SA总蛋白回收率为29.8%，纯度为97%。ALP标记SA的总蛋白回收率为56%，纯度为98%，分子量为159kD，其中ALP分子量为94kD，生物活性良好。5-氟水杨酸磷酸酯，测得熔点为157℃～159℃、纯度为99.43%～100%、红外吸收光谱、紫外吸收光谱及核磁共振谱等特性鉴定与文献记载一致。结论  研制成的各种关键试剂质量良好，已成功地应用于科研中。

    【关键词】  酶放大镧系元素发光；辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；碱性磷酸酶标记链霉亲和素；5-氟水杨酸磷酸酯

      The studies of the key reagents for enzyme-amplified lanthanide luminescence time-resolved fluorescence assay

    SONG Na-ling，ZHAO Qi-ren，LI Mei-jia，et al. The Key Laboratory of Molecular Nuclear Medicine, Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Tianjin 300192,China

    【Abstract】  Objective  The key reagents were studied for enzyme-amplified  lanthanide luminescence (EALL) time-resolved fluorescence assay (TRFA).  Methods  Horseradish peroxidase-labeled streptavidin (HRP-SA) was developed by sodium periodate method, alkaline phosphatase-labeled streptavidin (ALP-SA) was developed by two steps method of glutaraldehyde and 5-fluorosalicyl phosphate(5-FSAP) was synthesized chemically. Results  The recovery rate of total protein of HRP-SA was 29.8%, purity was 97%. The recovery rate of total protein of ALP-SA was 56%, purity was 98%, the molecular weight was 94kD, biological activity was good. Determined 5-FASP melting point was 157℃～159℃, purity was 99.43%～100%, the characters of infrared absorption spectrum, ultra-violet absorption spectrum and nuclear magnetic resonance spectrum accorded with literature recordation. Conclusion  The developed key reagents had good quality and were used successfully in EALL FRFA.

    【Key words】  enzyme-amplified lanthanide luminescence; horseradish peroxidase-labeled streptavidin; alkaline phosphatase-labeled streptavidin; 5-fluorosalicyl phosphate

    镧系元素发光时间分辨荧光分析(lanthanide luminescence timie-resolved fluorescence assay)广泛地应用于蛋白和核酸分析中。用于核酸杂交分析时，这种分析方法的基本原理如下［1～3］：先用抗体包被微滴定孔，再经特异抗原标记的靶DNA与该抗体反应，将靶DNA连接到固相抗体上。然后用生物素化探针与靶DNA杂交，再通过生物素（B）与链霉亲和素(SA)的反应，将链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶（HRP-SA）连接到杂化物上。当加入含有H2O2和生物素化酪胺（B-T）的HRP的底物溶液，因有H2O2存在，HRP在催化酪胺氧化，产生游离基团的同时，也催化事先固定在微滴定孔表面的蛋白质（如白蛋白）的酪胺酰基的氧化。由于二聚体形成反应，于是生物素化酪胺（B-T）就共价地结合到固相上。再加入碱性磷酸酶标记链霉亲和素   （ALP-SA）， 经B与SA的反应，ALP结合到固相上。至 此，实现了杂交和建立了杂交的定量关系。洗涤后，加入ALP的底物5-氟水杨酸磷酸酯（5-FSAP），ALP作用于5-FSAP，产物为5-氟水杨酸(5-FSA)，再加发展溶液，5-FSA与发展溶液中的Tb和EDTA形成发射高产额、长荧光寿命的5-FSA:Tb:EDTA三元复合物。由于，过量的5-FASP和Tb-EDTA都不干扰信号测量，可用时间分辨荧光仪直接测量荧光强度，确定待测DNA的量，而无需另行分离，方法很简单。本分析系统主要包括关键试剂的研制和分析系统的建立，本文介绍了HRP标记SA、ALP标记SA和5-FSAP等关键试剂的研制。

    1  材料与方法

    1.1  材料  戊二醛，天津市大茂化学试剂厂；碱性磷酸酶，美国Sigma公司；链霉亲和素，美国Promega公司；标准蛋白，Phast Gel Gradient 8%～25%和Agarose IEF，瑞典Pharmacia Biotech公司；高碘酸钠，硼氢化钾，天津市大茂化学试剂厂；对-氟茴香醚，Sigma公司；紫外分光光度仪（DU 800型），美国Beckman公司；Phast system水平电泳仪，瑞典Pharmacia Biotech公司；自动分部收集器（BS-100型），上海泸西仪器厂；离心机（LD5-2A型），北京医疗离心机厂。

    1.2  方法

    1.2.1  辣根过氧化物酶标记链霉亲和素  采用过碘酸钠法。过碘酸钠是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基，然后与SA的氨基结合,形成HRP-SA。HRP 1mg与60mmol/L NaIO4 0.1ml于4℃作用20min，加入0.16mol/L乙二醇0.1ml 30min后，加SA 1mg，4℃静置24h，透析过夜，加等体积的饱和硫酸铵溶液，4000r/min离心15min，将沉淀物溶解于pH 7.4的PBS中。280nm下测吸光度并进行200～800nm波长扫描。

    用sephadex G-75装柱。HRP-SA上样100μl，用0.025mol/L KCl-0.2mol/L乙酸缓冲液以0.5ml/2min的速度淋洗，分部收集。用DU800紫外分光光度计测量收集的各管样品的OD280值，绘制柱层析图谱(洗脱曲线)，据此收集蛋白峰。透析脱盐和用PEG-2000进行浓缩。

    1.2.2  碱性磷酸酶标记链霉亲和素  采用戊二醛二步法。在ALP中加入过量戊二醛，戊二醛的一个醛基即与ALP的氨基结合，充分透析除去未结合戊二醛，加SA与结合了ALP的戊二醛的另一个醛基结合。取133μl含1.25%戊二醛的0.1M PB(pH=6.8)，加入0.5ml ALP（1.667mg）中，混匀， 22℃过夜反应，透析。加入1.0mg SA和67μl 1M Na2CO3-NaHCO3缓冲液，混匀，置4℃下反应24h。加入7μl 0.2mol/L赖氨酸溶液反应2h，终止反应。用0.05M PBS(pH=7.2)缓冲液4℃下透析12h脱盐，4000r/min离心15min，取出上清液置4℃保存备用。280nm下测吸光度并进行200～800nm波长扫描。

    纯化方法与1.2.1的相同，ALP-SA上样100μl。采用考马斯亮蓝G-250染色法进行了蛋白浓度的测定［4，5］。

    为了测定ALP-SA的分子量，进行了聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳［6］和SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳。配制浓度为1.022mg/ml ALP-SA电泳储备液、1.084mg/ml HRP-SA电泳储备液和1.086mg/ml B-T电泳储备液。然后制备相应的电泳样品，在Phast Gel Homogeneous 12.5凝胶片上上样，每个样品4μl。

    将SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳结合测定SA-ALP分子量。在20μl SA-ALP原液中加入60μl样品溶解液和20μl 60%蔗糖溶液，混匀。将标准蛋白10μl和加入样品溶解液的样品分别用混匀器混匀，100℃上加热5min后，2500转/min离心5min。在Phast Gel 梯度8%～25%凝胶片上上样，每个样品4μl。

    1.2.3  5-氟水杨酸磷酸酯（5-FSAP）合成［7］  以对-氟茴香醚(Ⅰ)为原料，与乙酰氯在无水三氯化铝的存在下反应得到5-氟-2-甲氧基苯乙酮(Ⅱ)，将(Ⅱ)用氧化剂次溴酸钠氧化得到5-氟-2-甲氧基苯甲酸(Ⅲ)，脱甲基后得到5-氟水杨酸(Ⅳ)。(Ⅳ)与五氯化磷作用得到5-氟-苯甲酸-2-磷酸酯，即5-FSAP。

    5-FSAP的红外光谱分析：委托南开大学中心实验室作5-FSAP红外光谱。仪器：MAGNA-560FT-IR (Nicolet公司)，即：MAGNA-560付里叶变换红外光谱仪(美国尼高力公司)。方法： KBr压片法。

    5-FSAP核磁共振图谱分析［8］：委托南开大学核磁实验室作了5-FSAP的1H核磁共振图谱和31P核磁共振图谱，仪器：Bruker AC-P200 MHZ核磁仪。

    5-FSAP的紫外光谱分析：用0.01mol/L HCl作溶剂，使用Beckman公司DU 800紫外分光光度计测量5-FSAP在200～800nm波段的吸收光谱。

    薄板层析法检测5-FSAP的纯度：用硅胶GF254铺板，使用双波紫外灯(254，365nm)观察结果。用丙酮:氯仿:冰乙酸(2:2:0.5)作展开剂，分别用5-FSAP、5-FSA点样，使用双波紫外灯观察结果。使用丙酮:氯仿(1:1)作展开剂，使用双波紫外灯。

    高效液相色谱法测定纯度：使用Backman高效液相色谱仪和C18分析柱(5u，4.6mm×25cm)，流动相为10%甲醇，流速1ml/min，UV 280nm检测，测量5-FSAP含量。

    5-FSAP熔点观察：使用BüCHI 535型熔点测定仪，测量5-FSAP的熔点。

    2  结果

    2.1  HRP-SA  取HRP-SA 10μl，去离子双蒸水稀释10倍，用紫外分光光度计在200～800nm波段进行扫描。其中，在230nm处有最大吸收峰，可能是溶剂的吸收峰；在280nm有次吸收峰，这是HRP-SA吸收峰。测量280nm处吸光度，OD280为1.0851。离心后上清液共150μl溶液，则获得的蛋白质总量为1.1382mg。投料总蛋白质为2 mg，收率为56.91%。

    HRP-SA的Sephadex G-75凝胶柱层析分部收集得88管淋洗溶液，用紫外分光光度计分别测量这88管淋洗溶液在280nm处吸光度，作吸光度图，见图1。其中主峰主要集中在第6管至第10管，共5管，蛋白的总标记收率为29.8%，纯度约为97%。收集这5管的淋洗溶液，透析脱盐并浓缩。

    2.2  ALP-SA  ALP-SA标记实验后，将离心后上清液取10μl，去离子双蒸水稀释10倍，用紫外分光光度计在200～800nm波段进行扫描。其中，在230nm处有最大吸收峰，可能是溶剂的吸收峰；在280nm有次吸收峰，这是SA-ALP吸收峰，OD280为1.5631。离心后上清液共200μl溶液，则获得的蛋白质总量为2.186mg。投料总蛋白质为2.667mg，收率为81.9%。

    ALP-SA的Sephadex G-75凝胶柱层析分部收集得54管淋洗溶液，用紫外分光光度计分别测量这54管淋洗溶液在280nm处吸光度，作吸光度图，见图2。其中主峰主要集中在第5管至14管，纯度约为98%。收集这10管的淋洗溶液，透析脱盐并浓缩后获得150μl ALP-SA溶液，含ALP-SA 1.533mg，纯化收率为70.1%。所以蛋白标记总收率为56%。

    对ALP-SA进行聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳，低分子量标准蛋白作参照，所得电泳图谱示于图3：其中，1为ALP- SA，浓度为465ng/μl；2为ALP -SA，浓度为300ng/μl；3为标准蛋白LMW Marker，浓度为1μg/μl；4为HRP-SA，浓度为493ng/μl；5为HRP-SA，浓度为320ng/μl；6为B-T，浓度为320ng/μl。

    低分子量标准蛋白LMW Marker蛋白质分子量范围为14.4～94kD。在图3中，可以看到的标准蛋白只有3条带，因为电泳时间过长，低分子量的蛋白跑出了凝胶外。而SA-ALP迁移较小则是因为分子量太大。

    SA分子量大约65kD，ALP分子量未知。而对应的HRP-SA中，HRP分子量为40kD，那么HRP-SA分子量则应在105kD左右。在图3中，4和5两条带为HRP-SA的电泳带，其位置在SA-ALP电泳带前，所以，ALP-SA分子量应大于105kD。另外，ALP-SA只有一条电泳带，则可以说明合成的ALP-SA纯度很高，没有其他蛋白质杂质。

    为了更好的判断ALP-SA分子量，我们又作了SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳，同时选用了高分子量标准蛋白和低分子量标注蛋白作参照，结果见图4。

    图4中，1和5为浓度不同的低分子量标准蛋白，3是高分子量标准蛋白，2和4则是浓度不同的ALP -SA。低分子量标准蛋白LMW Marker蛋白质分子量范围为14.4～94kD；高分子量标准蛋白HMW Marker中蛋白质分子量范围为53～212kD。

    SA-ALP有两条染色条带，分子量分别在65kD和94kD左右，考虑到SA的分子量为65kD，说明在电泳过程中SA-ALP发生了解离。所以，另一条染色条带应为ALP，即ALP分子量约为94kD。这样研制成的ALP-SA的分子量应为159kD。

    2.3  5-FSAP  5-FSAP的红外光谱分析图谱见图5。红外光谱IR（KBr，cm-1）2858～3079、1693、1590、1492、1458、1285、1192、1040、981、907、836，数据与文献值一致（分辨率：4cm-1，波数范围： 4000～400cm-1，扫描次数：20次）。

    5-FSAP核磁共振图谱分析：分别作了1H NMR和31P NMR。1H NMR（D2O作溶剂，TMS内标）图谱，δ（ppm）7.26-7.33（m，2H），7.46-7.53（m，1H）；5-FSAP的31P NMR（D2O作溶剂，TMS内标）图谱，δ（ppm）-3.94，数据均与文献值一致。

    5-FSAP的紫外光谱分析：用HCl作溶剂，在紫外分光光度计上作200～800nm波段扫描。5-FSAP在280nm处有最大吸收峰，和文献记载值一致；其中在200nm处的吸收峰，为溶剂成分吸收峰。

    薄板层析法检测5-FSAP的纯度：使用丙酮:氯仿:冰乙酸（2:2:0.5）作展开剂，5-FSAP点样，5-FSAP仍然在原点，没有移动扩散，双波紫外灯（254，365nm）观测下显紫色斑点，不存在原料或其他中间产物。使用5-FSA点样，相同情况下，5-FSA移动，接近展开剂展开前沿，双波紫外灯下显淡紫白色斑点。用丙酮:氯仿（1:1）作展开剂时，得到上述类似结果。

    高效液相色谱测定纯度：使用Backman高效液相色谱仪和C18分析柱（5u，4.6mm×25cm），流动相10%甲醇，流速1ml/min，UV280nm检测，不同批号5-FSAP的纯度在99.43%～100%。

    5-FSAP熔点测定：使用BüCHI 535型熔点测定仪，测量5-FSAP熔点为157℃～159℃，同文献值相符。测量不同批号、不同存放温度和不同存放时间的5-FSAP的熔点，其熔点变化不大，所合成的5-FSAP比较稳定。

    3  讨论

    酶标记SA的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。对于辣根过氧化物酶的标记，我们采用过碘酸盐氧化法，这种方法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与SA分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH4（或乙醇胺）还原生成稳定的酶标记物。

    在电泳测定SA-ALP分子量中，开始先进行了聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳，这是测定蛋白质分子量比较好的方法。可是，由于标准蛋白选择了低分子量，而SA-ALP分子量太大，因此，电泳结果不够理想(见图3)，低分子量标准蛋白超出了凝胶范围，而SA-ALP迁移较小，无法判断其分子量。但是，在这次结果中，我们可以看出SA-ALP电泳带只有一条，证明合成的SA-ALP纯度很高，没有其他蛋白质杂质。

    后来进行了SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是测定蛋白质亚基分子量比较好的方法。我们在进行这次电泳前，考虑到了电泳过程中，SA-ALP会解离。因为处理样品需要100℃加热5min且样品溶解液中含有SDS 和β-巯基乙醇，β-巯基乙醇是蛋白质分子中二硫键的还原剂，使多肽组分分成单个亚单位；SDS可打断蛋白质的氢键，与蛋白质结合后，可引起蛋白质构象的改变。因此，在电泳结果(见图4)中可以看到SA-ALP出现两条带，其中一条带分子量大约65kD，另一条带分子量大约94kD。而我们知道，SA分子量正是65kD，那么另一条带就是解离下来的ALP，其分子量大约94kD。这样，我们可以推算SA-ALP的分子量应为159kD左右。结合图4，SA-ALP的电泳结果与低分子量标准蛋白中分子量最高为94kD的Phosphorylase和分子量大约为105kD的HRP-SA的电泳结果相比，其位置基本与其分子量相符。

    4  结论

    成功地合成了核酸杂交的镧系元素发光时间分辨荧光分析中的HRP标记SA、ALP标记SA和5-FSAP等关键试剂，为核酸杂交的镧系元素发光时间分辨荧光分析系统的建立打下了很好的基础。（本文图片见封三）

    【参考文献】

    1  Campbell CN, Gal D, Cristler N, et al. Enzyme-amplified amperometric sandwich test for RNA and DNA. Anal Chem, 2002， 74(1):158-162.

    2  Meyer J, Karst U. Enzyme-linked immunosorbent assays based on peroxidase labels and enzyme-amplified lanthanide luminescence detection. Analyst, 2001， 126(2): 175-178.

    3  Evangelista RA, Pollak A, Templeton EG. Enzyme-amplified lanthanide luminescence for enzyme detection in bioanalytical assays. Anal Biochem, 1991, 197:213-224.

    4  卢圣栋.现代分子生物学实验技术.北京：中国协和医科大学出版社，1999.

    5  赵亚力,马学斌,韩为东.分子生物学基本实验技术.北京：清华大学出版社, 2006,.

    6  Rothe GM, Purkanbaba H. Electrophoresis. 1982(3): 33-42.

    7  Lacock RC. Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Function Group Preparation. Wiley-VCH， 1999, New York.

    8  方惠群,于俊生,史坚.仪器分析.北京：科学出版社， 2002.

    *基金项目：天津市自然科学基金（批准号：043610211）

    作者单位：300192 天津，中国医学科学院 中国协和医科大学放射医学研究所，天津市分子核医学重点实验室

　　 (编辑：秋  实)