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【摘要】 IFN的产生与dsRNA之间的相关研究已获得显著进展，目前已发现细胞内有两种酶（PKR，25AS）与干扰素的产生密切相关，而且在干扰素诱生的过程中，dsRNA链上的多聚肌苷胞苷酸（聚肌胞）Poly（I:C）能被双链RNA依赖蛋白激酶（PKR）特意性激活。DsRNA与干扰素间的相关性还表现在许多细胞调节因子和效应因子上，例如IRFs，Mx蛋白，Toll-Like受体的mAb和一些细胞因子，同时，dsRNA能通过IFN的诱生来激发细胞产生凋亡现象，若两者之间的相关性通过细胞转染技术来实现，则可得到进一步的探讨和研究。
【关键词】 干扰素；dsRNA；转染，凋亡
Correlation and transfection applying betneen dsRNA and interferon
WANG Hai-qi.Biology Engineering College of Jimei University,Xiamen 361021,China
【Abstract】 The distinct advance have been formed about the correlation rsearch between dsRNA and interferon(IFN), recently it’s found that there are two enzymes in the cell tightly correlating with the production of IFN. And during the production of IFN induction, the polyinosinic polycytidylic Acid, poly（I:C）in the dsRNA chain could be specific activated by double-stranded RNA-dependent protein kinase(PKR).In addition,many cellar regulator and effector also expressed the correlation between IFN and dsRNA,such as interferon regulatory factors(IRFs), mx protein,the mAb of toll-like receptor, and some cytokine.Simultaneously,dsRNA could activate the cell programmed death through the induction of IFN, if the correlation could be realized and communicated by the technology of cell transfection, it would be exploited and researched more deeply and completely.
【Key words】 IFN ；trsansfection；dsRNA；apoptosis
干扰素(Interferon, IFN)在抗病毒感染领域已获得广泛深入研究，是细胞因子四大家族成员之一，IFN能诱导细胞进入抗病毒状态和限制病毒扩散。也有报导表明大部分被dsRNA病毒感染的细胞会产生凋亡现象［1］。同时在已建立的许多实验模型中发现，单独通过I型IFN刺激细胞不能诱导细胞产生凋亡现象，但用小分子dsRNA（＞30）片段转染细胞则可检测到凋亡现象。事实上，现今大量实验研究证实IFN在限制病毒扩散，诱导未感染细胞的抗病毒状态和诱导感染细胞凋亡等具有多重功能。下面将从dsRNA诱导IFN产生的机制以及相关影响调节因素和转染在dsRNA诱导产生IFN中的作用予以详细论述。
1 dsRNA诱导IFN产生的起因和机制
目前普遍认为IFN分为两型，I型IFN由两组血清学不同的蛋白质组成，第一组称为α-IFN，由二十种结构相关的大约18KDa多肽链组成的家族，每一种由不同的基因编码，其主要来源为单核吞噬细胞，故又称为白细胞干扰素。第二组是由单个基因产物所组成，是一种20KDa的糖蛋白，称为β-IFN，其细胞来源是培养的纤维母细胞，故又称为纤维母细胞干扰素。II型IFN又被称为免疫型的干扰素，即γ-IFN，其一般功能是调节单核巨噬细胞的免疫应答功能，由Th细胞和NK细胞产生。在IFN诱生的过程中不能不提到双链RNA依赖蛋白激酶（double-stranded RNA-dependent Protein Kinase, PKR）的作用，它是整个细胞内信号传导通路的关键因子，同时还有2’，5’寡腺苷酸合成酶(2，5-Oligoadenylate Synthetase, 2’,5’AS)，这两种酶与dsRNA诱生IFN密切相关。早在1994年，McNair［2］等人在研究HDV基因组时发现HDV的环状ssRNA具有膜内互补结构，能在胞内形成一杆状dsRNA，若此dsRNA在胞内存在暴露状态，它将诱导IFN表达，激活两种IFN诱导的dsRNA依赖的激酶，具有抑制病毒活力的作用。在1997年，Kumar.A等人［3］再对PKR进行深入研究时指出，PKR是一种IFN诱导的双链RNA激活的苏/色氨酸蛋白激酶，被dsRNA的多聚肌苷胞苷酸（聚肌胞）Poly（I：C）(Polyinosinic Polycytidylic Acid)特异性激活，进入信号转导通路，引起核内转录因子变化。同时还发现PKR存在抗细胞增殖效应。这两种应答密切相关，PKR首先磷酸化真核细胞转录因子(eukaryotic Initiation Factor-2 alpha, eIF-2α)，从而抑制蛋白质合成，使细胞停滞于G0/G1和G2/M期，并诱导凋亡，同时通过磷酸化核内转录因子(Nuclear Factor-KappaB, NF-KappaB)的抑制因子I-KappaB( Inhibitor of Nuclear Factor-KappaB)，使NF-KappaB释放并得到活化，引起一系列IFN相关刺激因子启动子活化导致转录启动进行。而dsRNA同样也促进2’,5’AS合成，结果导致RNase即主要为RNaseL的非特异性活化，降解细胞内所有的mRNA，致细胞死亡。Rivas.C等人［4］在对IFN抗病毒效应的研究中发现，为了抵消IFN的作用，动物病毒常常特异性阻断以上IFN相关信号传导通路，例如牛痘病毒(Vaccinia Virus, VV)编码的E3L蛋白，是一种dsRNA相关蛋白，且证实其能特异性抑制IFN诱导的PKR激活效应。同时在Carcia.MA［5］的一篇研究报道中指出VV的E3L同样能抑制IFN诱导的2’,5’AS/RNaseL系统和其他dsRNA依赖途径，从而形成VV的有效复制。其中的机制在Cacia建立的稳定表达E3L的NIH3T3细胞系中得到证实：eIF-2α磷酸化受抑以及I-KappaBα对dsRNA诱导产生的降解不应答。因此进一步证实了dsRNA诱导的PKR途径是IFN产生的主要信号传导通路。
2 dsRNA诱导IFN产生的相关因素
2.1 IFN调节因子(Interferon Regulatory Factors, IRFs) IRFs［6］是一类与调节细胞对IFN和病毒感染的应答有关的DNA相关蛋白家族，而IRF-3是IFNα/β基因表达的关键管理调节因子［7］。在对流感病毒dsRNA相关蛋白NS1的研究中表明能通过阻止IRF的激活来阻遏抗流感病毒的IFN应答效应。dsRNA可通过诱导IRF转录因子活化而产生IFN相关表达基因561的表达。但在Peters.KL［8］等人对突变细胞株P2.1的研究中发现RNA在这种细胞系中未能有效激活NF-KappaB和IRF-3，同时，561mRNA和IFN-βmRNA也未能有效转录。其中IRF途径被测定为在细胞水平蛋白含量极低，因为在P2.1细胞中IRF降解率较高，当在其衍生的细胞克隆株中转染不同水平的IRF基因时，dsRNA能有效恢复对IRF-3的刺激，而561基因的mRNA和IRF的mRNA也能在细胞中强烈表达。当抑制NF-KappaB的激活时，上述两者仍能高表达，IRF的强转录活性由此可见一斑。在另一研究中又发现一新的IRF因子—IFR-9，其mRNA能被dsRNA短暂诱导，但其mRNA编码的蛋白质远不同任何已知的哺乳动物IRF。而IRF-1和IRF-2在管理基因表达功能上仍不十分清楚，有报道指出IRF能使IFN产量增加［9］，但许多IRF相关因子还处于未知领域，有待进一步探索。
2．2 IFN诱导基因 IFN的诱导主要涉及转录因子的激活，而控制调节病毒激活的转录启动子元件已被广泛研究，实验已证实的四个基因结构域PRDⅠ—PRDⅣ参与了IFN基因的诱导表达，其中PRDⅠ和PRDⅡ相对重要突出［9］。PRDⅠ与干扰素刺激应答元件(Interferon Stimulated Response Elements , ISREs)类似，呈现在许多IFN诱导基因中，已证实其能与IRF-1和IRF-2相联接，产生相关效应，而PRDⅡ是一NF-KappaB位点，一般通过不同的刺激因子与其抑制因子亚小体结合而使抑制子失活，从而导致自身激活。其他两个结构域也参与IFN刺激应答反应，但功能仍不清楚。IFN的启动区基因IFN-α1、IFN-α2、IFN-α4、IFN-α11，在实验研究后发现都含有一段保守的46bp富含GAAATG的基序，同样类似于ISREs，表明这段基序对IFN的诱导尤为重要。
2.3 Mx蛋白(Mx Protein) 同样也是在IFN诱导脊椎动物细胞转入抗病毒状态的过程中发现 ［10］ , Jensen.I等人深入研究时发现在人和小鼠细胞中，Mx蛋白组成了一个IFN诱导的抗病毒蛋白家族。最近，Mx蛋白被科学家从亚特兰大三文鱼中克隆获得，而且在三文鱼的CHSE-24细胞中，dsRNA和IFN活力因子能成功诱导Mx蛋白表达，而且只有Mx蛋白能有效抵抗胰腺坏死性病毒的感染［10］，充分说明了Mx蛋白与IFN的抗病毒效应密切相关。
2.4 TLR(Toll-like Receptor)的单克隆抗体(monoclonal Antibody, mAb) 在研究PKR及其类似信号转导途径中，Mastsumoto.M等人 ［11］通过成纤维细胞表面表达TLR3受体，特异性选择针对TLR3的mAb来抑制PolyI：C调节产生的IFN，且已知人成纤维细胞在被病毒感染或dsRNA刺激时，可经信号传导通路产生IFN，鉴于此信息，通过基因测定手段发现转染有人TLR3表达载体的HEK293细胞经TLR3辨认dsRNA从而激活NF-KappaB和IFN启动子，而且只有外膜TLR3特异性辨认dsRNA时才能产生IFN，因为如果用mAb与TLR3结合，则这种特异性激活将被打断［12］，断定TLR3是IFN信号通路的有效细胞膜受体之一。
2.5 细胞因子 大部分细胞因子之间都能相互影响调节，而很多细胞被病毒感染或被dsRNA刺激诱导时（除了胚胎性癌细胞，因其缺乏IFN表达基因）除能产生IFN外，也分泌许多生长因子，例如IL-1，CSF，TNF也诱导IFN产生，而IFN-α和IFN-β自身能增强IFN表达诱导基因的能力 ［13］还有一些蛋白合成抑制剂例如放线菌酮通常能增强IFNmRNA表达水平。
3 dsRNA经IFN诱导的凋亡现象
研究证实，病毒感染细胞引起凋亡相当多见，其机制也与PKR和2’,5’-AS/RNaseL途径相关［14］,导致细胞全面的基因表达受抑和凋亡，将dsRNA导入细胞后同样是激活PKR和2’,5’AS，活化的PKR磷酸化eIF-2α,使其活性下降从而抑制基因表达，而激活的2’,5’AS合成2’,5’寡腺苷酸活化RNaseL降解mRNA，基因表达受抑，最终细胞凋亡。在对呼肠孤病毒诱发的小鼠心肌炎模型中发现［13］，IFN诱导的抗病毒活性基因PKR激酶磷酸化eIF-2α，引起小鼠心肌细胞凋亡。Nanbo.A［14］也在其对细胞感染Epstein-Barr病毒（EBV）后能抵抗IFN引起的抗肿瘤效应中发现凋亡现象的存在，其中主要的效应因子是EBV编码的PolyA尾以上的RNA序列(EBV-encoded Poly(A) super (-) RNAs, EBERs)，能与PKR结合，阻止PKR磷酸化而激活，从而对PKR激活后产生的一系列凋亡信号诱导通路不应答。这些研究结果都证实dsRNA能诱导细胞凋亡。
4 转染在RNA诱导IFN途径中的作用
Pattyn.E等人［15］在对IFN研究中建立了红细胞生成素受体( Erythropoietin Receptor, EpoR)与I-IFN受体亚单位跨膜形成融合体即嵌合受体IFN-αR1和IFN-αR2，将其转染入11.1细胞，发现EpoR/IFNαR能转导Epo刺激信号，这一发现可通过I-IFN诱导的启动子IFN-6-16来鉴定。Gao.Y［16］在其对EBV的阳性肿瘤细胞系Daudi与IFN-α关系的研究中发现，经转染实验，EBV阳性和阴性的淋巴细胞都能转染dsRNA，从而诱导细胞增殖水平下降，这些研究是转染在dsRNA诱导IFN中的直接应用。在Rivas.C［4］进行的转染实验中，将一表达VV编码的E3L蛋白（一种RNA相关蛋白）的基因以2’,5’AS作载体转染入小鼠细胞，发现被2’,5’AS诱导的凋亡现象受到抑制，这是转染实验在研究IFN方面的间接应用，通过凋亡受抑来判断dsRNA诱生IFN［17］。在许多实验研究中都发现，单独通过IFN诱导凋亡并不顺利实现［18］，若经转染实验作为诱导条件，将dsRNA导入目的细胞，凋亡现象将自然产生［19］。
5 dsRNA转染技术的前景展望
IFN与dsRNA的密切联系不须进一步详述，其联系必须经转染技术来作为桥梁而实现两者间的沟通，从而得到更深入的研究，而且通过转染可实现dsRNA使IFN进一步发挥其诱导凋亡途径的优势，达到非特异性或全面地抑制基因表达［20］，使转染有dsRNA的目的细胞增殖能力下降，细胞转入凋亡状态。个人认为dsRNA转染从而诱生IFN这一实验技术将具有以下几个方面的意义：(1)抗病毒增殖，使病变细胞增殖受限。(2)抗肿瘤效应，可将特定的dsRNA转染入目的靶细胞，引起肿瘤细胞增殖受抑，进入凋亡途径。(3)在基因工程和分子生物学方面，可利用重组dsRNA与载体相联，转染入细胞表达目的基因，研究目的基因的相应功能，使基因研究进入亚分子水平。
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作者单位：361021 福建厦门，集美大学生物工程学院
(编辑：悦 铭)