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【摘要】 目的 探讨旋转强恒磁场（RCSMF）对SD大鼠的骨骼生长发育及相关激素的影响，为RCSMF促进人体增高的临床应用奠定基础。 方法 取25日龄的 SD大鼠置RCSMF下，1.5h/d。每5天取血检测大鼠生长激素（GH）、类胰岛素生长因子（IGF-I）、雌激素（E2）等与骨骼发育相关的激素，同时测量每组大鼠的身长、体重和尾长，并用骨形态计量学方法研究RCSMF对大鼠骨组织形态学和动态学参数的影响。 结果 RCSMF处理后大鼠的身长［实验组（25.28±0.41）cm，对照组（24.05±0.35）cm；P＜0.01］、体重［实验组（445.90±16.88）g，对照组（382.22±12.78）g；P＜0.01］、胫骨长［实验组（3.89±0.13）cm，对照组（3.66±0.10）cm；P＜0.01］和股骨长［实验组（3.65±0.08）cm，对照组（3.51±0.06）cm；P＜0.01］，上述多项参数以及骨骺板等相关形态计量学数据实验组明显高于对照组。回归分析身长与相关激素的关系显示：大鼠身长与GH、IGF-I和E2有显著相关性。 结论 RCSMF有促进骨骼生长发育的作用，其作用机理是通过刺激与骨骼生长发育相关激素的生成、释放，并影响软骨细胞的增殖功能来完成的。
【关键词】 旋转强恒磁场；骨骼发育；内分泌激素
Effect of rotary constant-strength magnetic field（RCSMF）on skeleton growth and related hormones in SD rats
LI Ling， WU Zhao-zhi， Ma Lun，et al.
College of Life Science， Shenzhen University， Shenzhen 518060， China
【Abstract】 Objective To investigate the effect of rotary constant-strength magnetic field（RCSMF）on skeleton growth and related hormones， which potentially provides clues for the clinical application of increased human higher. Methods 25-day-old SD rats experimental group (EG) were exposed to the RCSMF 1.5 hours each day. Then measured the body length， weight and tail length， hormones related to the skeleton growth every five days， such as GH， IGF-I and PTH. The effect of RCSMF on morphological and dynamic parameters of SD rats was studied by bone histomorphometry. Results Compared with control groups (CG)， the values of the parameters， such as the body length（EG: 25.28±0.41cm， CG: 24.05±0.35cm； P＜0.01）， body weight（EG: 445.90±16.88g， CG: 382.22±12.78g； P＜0.01）， shin bone length（EG: 3.89±0.13cm， CG: 3.66±0.10cm； P＜0.01） and thigh bone length（EG: 3.65±0.08cm， CG: 3.51±0.06cm； P＜0.01） increased apparently. Regression analysis showed that the correlation between the body length and the related hormones was significantly. Conclusion RCSMF can increase the skeleton growth by the mechanism of exciting the formation and release of the related hormones and impacting the proliferation of cartilage cells.
【Key words】 rotating constant-strength magnetic field； skeleton growth； endocrin hormones
大量文献报道磁场具有较好的临床治疗效果，如改善人体微循环、促进骨折愈合、防治骨质疏松等。身高是反映人体素质和美学的一个重要因素，一些青少年因先天遗传或后天发育不良等因素导致的身材矮小已越来越被人们所关注。如何健康、无害且有效地提高国民身体高度越来越被生物医学界所重视。根据磁场对人体作用的基本原理，我们希望通过观察旋转强恒磁场（RCSMF）对大鼠骨骼生长发育的影响实验研究，探索RCSMF促进骨骼生长发育的 可能性和条件，为RCSMF促进人体增高的临床应用奠定基 础。
1 材料与方法
1.1 实验仪器 RCSMF采用本实验室研制的HMF-6000磁场治疗装置(中国发明专利号2L93118017.1，美国发明专利号为5.667.469 )，磁源由稀土磁钢制成，经特殊磁路设计，强度0.4～1T，旋转频率可调，旋转时在磁体上方 20cm内形成一个直径60cm的有效半球形旋转磁场，能够把整只大鼠放入磁场处理。
1.2 实验动物 健康SPF级Sprague–Dawley SD幼年大鼠（21日龄，简称21d)200只，由广东省医学动物实验中心提供（动物质量合格证2005A010）。体重50～60g，雌雄分笼饲养，颗粒饲料喂养每只20～30g/d，自由饮水，动物房温度18℃～25℃，湿度50%～70%。
1.3 动物分组及磁场处理 将SD大鼠随机分为对照组（A组）和实验组（B组）， A组分为雌鼠（a1），雄鼠（a2）；B组分为雌鼠（b1），雄鼠（b2）。预养至25天进入实验， B组每天放置于RCSMF时间为90min，旋转频率为4Hz。每隔5天分别测量两组大鼠的体长（从鼠的鼻尖到尾根部）、尾长和体重。
1.4 观测生化指标 每5天从各组大鼠中随机抽取4只，禁食12h（不禁水），乙醚麻醉后，杀取腹主动脉血8ml，分离血清(3000r/min，离心15min) ，-80℃冷冻保存。检测项目：类胰岛素生长激素（IGF-1）、甲状旁腺素（PTH）、骨钙素（BGP）、雌二醇（E2）四种激素测定均按Diagnostic Systems Laboratories 所提供试剂盒和方法检测；血清生长激素（GH）测定按 Linco Research 所提供的试剂盒和方法检测。检测项目均采用放射免疫法，由中国同位素公司和深圳市人民联合医院放免检测中心检测。
1.5 形态观察 (1) 每5天截取后肢胫骨近端和股骨远端，10%福尔马林固定，甲酸、盐酸混合脱钙，石蜡包埋，切片7～9μm，HE、甲苯胺蓝染色。用OLYMPUS BX51照相，并用Image pro软件分析生长板厚度EBT (mm)、增殖带厚度BC (mm)、生长板细胞层数EBF、肥大软骨细胞直径BD (μm)、次级骨小梁宽度TCW (mm)、次级骨小梁面积百分数TCP (%)、骨小管直径VC (μm)、骨小管间距(μm) VCS 等数据。(2) 取前后肢跗骨用0.1%茜素红，1%的氢氧化钾溶液进行骨骼染色，用甘油脱水透明，观测足跗骨部的骨化中心。(3) 用0～100mm，精确度为0.02mm的游标卡尺分别测量各组大鼠的胫骨和股骨长以及股骨中段皮质厚度，计算厚度与长度比值，并进行组间对比研究。
1.6 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，进行回归分析和t检验。
2 结果
2.1 大鼠的形态测量
2.1.1 SD大鼠的生长曲线 如图1～4所示，随着日龄的增长，各组的身长和体重平稳增长，B组的增幅明显大于A组。
图1 － 图4 略
2.1.2 不同实验阶段各组大鼠身长与体重的值 见表1。如表1所示，实验后，两组比较：30天，体重和身长差异无显著性（P>0.05）；35天，B组身长大于A组身长（P<0.05）；45天，B组身长显著增加（P<0.01），B组体重明显大于A组（P<0.05）；65天，B组体重显著大于A组（P<0.01）；至实验结束，各组间比较身长与体重的比值差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.1.3 不同实验阶段各组大鼠的尾长值 见表2。如表2所示，实验后，两组比较：30天，尾长无明显差异（P>0.05）；35天，尾长有差异（P<0.05）；45天，尾长差异无显著性（P＞0.05）。
表1 不同实验阶段各组大鼠身长与体重的值 略
表2 不同实验阶段各组大鼠的尾长值 略
2.2 与骨骼发育相关激素
2.2.1 血清激素水平观测 如图5所示，30～45天，B组的PTH、IGF-I、E2、GH水平明显高于A组，但是两组的BGP水平则差异无显著性；45～55天，A组的GH、E2、BGP明显高于B组，而B组的PTH和 IGF-I则高于A组；55～60天，B组的GH、PTH、BGP高于A组，而IGF-1则B组低于A组， E2变化两组相差不明显。
图5 五种激素在生长过程中分泌图 略
如表3 所示，SD大鼠青春期实验组IGF-I和GH分泌水平显著高于对照组。而 PTH、E2、BGP则差异不明显。
表3 30～60天两组激素水平比较 略
2.2.2 身长与几种激素的相关性分析 见表4。由表4所示，身长同GH、IGF-I和 E2的水平呈显著的正相关；PTH、BGP与身长的相关性不明显。
2.2.3 身长影响因素的多元线性回归分析结果 以身高为因变量，GH、IGF-I、E2、PTH和BGP为自变量的多元回归分析中。B组r=0.84，P＜0.01；B组r=0.94，P＜0.01可以很好的代表身高与各种激素之间的线性关系。
表4 身长与相关激素相关分析 略
2.3 长骨的测量结果 见表5。表5所示，大鼠的胫骨和股骨以及股骨直径相比较B组明显高于A组（P＜0.01），但两组间的股骨中段直径与股骨长之比差异无显著性（P＞0.05）。
表5 两组100天时大鼠长骨比较 （略）
2.4 观察大鼠骨化中心 观察着足跗骨部骨化中心出现情况，30天时两组足部距骨、中央骨、舟骨、月骨、三角骨、豆骨都已出现；65天时头状骨、钩骨、大小角骨的关节面已经建立，各骨化中心都已完成骨化，组间相比较差异无显著性。
2.5 切片图 见图6～8。如图6所示，两组生长板增殖区软骨细胞生长正常，都呈典型柱状排列； B组骨骺板明显比A组增厚。
图7－图8 略
2.6 生长板形态计量 见图9。图9所示，大鼠40日龄时，两组间EBT、EBF、VC、VCS、BC差异均有非常显著性（P＜0.01）；BD差异有显著性（P＜0.05）；TCW、TCP差异无显著性（P＞0.05）。 注：A组与B组比较
图9 大鼠40日龄形态指标测定 略
3 讨论
3.1 未见磁场的毒副作用 目前有不少磁疗器具被运用于促进青少年的骨骼发育，但常见的磁疗器械磁场强度最高仅30～50毫特(mT)，对人体生长发育作用效果不明显。对此，我们使用由永磁材料钕铁硼磁钢制成的强恒磁场进行研究，强度在0.4～1T之间。根据美国食品和药品管理署（FDA）［1］明确指出4T以下的恒定非电磁场对人体无危害；Okazaki等［2］在4.7T的恒定磁场下对小鼠胚胎发育进行研究，发现磁场未对它造成任何影响；张小云等［3］ 研究显示长时间处于4T超导恒定磁场下的大鼠，未发现磁场的急性和慢性的毒副作用。同时，本文观察不同日龄SD大鼠在RCSMF下骨形态学变化结果，显示骨细胞形态发育正常，骨板排列规则，未发现RCSMF对骨形态学的负面影响和副作用。
3.2 磁场对骨形态的影响 青少年骨骼生长发育中，骺板软骨是骨生长最活跃的部位，其发育直接关系到长管状骨的生长发育。骺板从解剖上分为三部分：（1）由不同软骨细胞组成的软骨髓板；（2）骨化的干骺端；（3）骺板周围的Ranvier软骨膜骨化沟。其中软骨髓板分三层依次为贮存带、增殖带和肥大细胞带增殖带是髓板纵向生长的所在，而Ranvier软骨膜骨化沟则是髓板横向生长的所在［4］。生长板软骨是位于初级骨化中心和次级骨化中心之间的高度有次序排列的组织。生长板的厚度、生长板中细胞柱的密度、次级骨小梁面积都是体现生长板活性的重要指标。生长板细胞柱细胞增殖的速率、合成基质的细胞成熟或增大速率，肥大细胞直径都可以用来衡量生长板的生长率［5］。实验观测虽然两组间的骨化中心形成时间无明显差异，但青春发育前期，骨切片的检测发现RCSMF对大鼠软骨细胞层有明显的影响。生长板软骨细胞的增殖、成熟及软骨基质钙化程度提高，生长板的厚度及生长板纵列总体细胞的数目也明显上升。后期两组骺板距都减小，但磁场处理后大鼠软骨细胞明显更加密集。我们的相关实验结果 ［6,7］磁场能够促进和诱导未分化的间充质向软骨细胞及成骨细胞方向分化，引起细胞的增殖、细胞碱性磷酸酶的活性增强。同时，破骨细胞置于磁场下，磁场解聚微管、微丝，从而抑制了皱折缘的形成，并破坏破骨细胞的极化，抑制破骨细胞增殖；另文也证明磁场能促进骨钙的沉积［8］，上述研究结果证明磁场能够促进新骨的形成。
3.3 磁场对激素分泌的影响 由James G. Fox等［ 9］研究证明大鼠在42～46天进入青春发育期，到60～65天性发育成熟。大量研究证明这时其内分泌腺的功能直接影响大鼠的生长发育。
GH可促进骨骺软骨细胞分裂，加速长骨的线性生长。并且还可通过IGF-I对骨的作用，间接促进骨形成和抑制骨吸收。增殖带原始软骨细胞上有大量的GH受体，GH可以促进DNA合成的软骨细胞数目增加，从而促进前软骨细胞变成增殖细胞［10］。IGF-I可刺激、复制骨谱系细胞（如前成骨细胞），影响其生长及分化；IGF-I还可促进胶原合成及基质的添加，降低胶原的降解和加强骨吸收细胞的聚集，为骨重建的主要调整剂，是维持骨量，促进骨折愈合的重要因子。E2直接作用于骨细胞上的雌激素受体(ER)，对钙调节激素和肾吸收因子均产生影响。可促进降钙素分泌，抑制骨吸收和甲状旁腺素的分泌，从而减少骨吸收。Reineckc等［11］ GH、IGF-I和E2水平的升高，能刺激大鼠生长板软骨细胞生长。
观察结果显示：RCSMF处理后，大鼠在青春发育期内分泌腺激素水平有明显改变。回归分析显示GH、IGF-1、E2与身长呈显著正相关，提示这几种与生长发育相关的激素分泌水平直接影响骨骼的生长发育。说明在青春发育期，RCSMF能够影响下丘脑-垂体-性激素，并促进相关激素大量分泌，最终影响身长的增长。相关文献［12～14］报道磁场作用下，能促进促软骨细胞生长的激素如类胰岛素生长因子（IGF-I）、骨形成蛋白（BMP）、转化生长因子（TGF-β）等大量分泌。
PTH与成骨细胞作用后间接刺激破骨细胞。PTH可诱导骨表面的成骨细胞发生形态学改变（变为梭形），同时通过改变原胶原信使RNA（mRNA）的活性而抑制骨胶原的合成［15］。观察结果显示，RCSMF处理后大鼠PTH分泌量高峰从35天延迟到45天。说明RCSMF可使青春期PTH分泌峰值延迟，从而有利于生长。
骨钙素（BGP）的基因表达受多种激素、维生素和局部细胞因子的调节。BGP是成骨细胞的特异性产物，可反映成骨细胞活性和骨代谢转换的水平 ［16］。激素检测中，两组数据整体差异不明显，表明RCSMF对青春期大鼠成骨细胞生成作用不明显。
3.4 磁场对大鼠身长的影响 文献报道大鼠在11～13周身体发育完全成熟，因此，我们把100天的大鼠定为身长增长终点和本实验观测终点。测量其相关形态指标，结果显示RCSMF能促进大鼠股骨和胫骨长以及股骨中段直径的增长，但未发现骨骼过度增粗。身长、体重和尾长测量显示，RCSMF能促进大鼠的生长，实验组身长、体重明显高于对照组，身长与体重比值两组无明显差异，提示RCSMF不会导致过度肥胖。
综上所述， RCSMF可刺激青春期大鼠生长相关激素的分泌，促进骨骼生长发育，无明显副作用。但是这些研究主要针对SD大鼠，RCSMF对人体生长发育的影响有待进一步研究。
（本文图6～8略）
【参考文献】
1 Kangardu A，Baudendistel KT，Heverhagen.JT.Clinical high- and ultrahigh-field MR and its interaction with biological systems.Radiologe，2004，44(1): 19-30.
2 Okazaki R，Ootsuyama A，Uchida S， 等. 4.7T恒定磁场对ICR小鼠胚胎发育的影响.放射研究杂志， 2001，42（3）；273-283.
3 张宇，张小云. 4T超导恒定强磁场对大鼠的急性毒性作用. 中国临床康复, 2006,10:1.
4 Nuttall JD， Brumfield LK， Fazzalari NL，et al. Byers Histomorphometric Analysis of the Tibial Growth Plate in a Feline Model of Mucopoly saccharidosis Type VI Calcified Tissue International,1999,65：47.
5 Loveridge N ，Farquharon C，Palmer R， et al. Growth hormone and longitudinal bone growth in vivo: short-term effect of a growth hormone antiserum.Journal of Endocrinology， 1995， 146-55.
6 张小云，刘栋，张晓鄂，等. 磁场对细胞生长分裂的影响及其机制的探讨. 中国科学，B辑，1989， (2): 164-170.
7 张小云, 张宇. 恒定磁场对骨组织中细胞影响的研究 Chin.J Osteoporos，August 2006， 12， 4.
8 张小云，丁振华，张宇.磁场治疗对实验动物体内钙分布的影响. 中国临床康复,2006,10(21):115.
9 James G. Fox， Bennett J.Cohen Franklin M. Loew， Laboratory Animal Medicine， Harcourt Brace Jovanovich， 1983.
10 Reineckc M， Schmid AC ，Heybergcr Meyer B.Effect of growth hormone and insulin-like growth factor-I(IGF-I) on the expression of IGF-I messenger ribonucleic acid and peptide in rat tibial growth plate and articular chondrocyctes in vivo .Endocrinology， 2000， 141( 8):2847.
11 Symons AL， Paxinos D， Leong K，et al. Effect of growth hormone on odontogenesis in the rat. J. Dent. Res,1995,74， 456.
12 Fitzsimmons RJ， Ryaby JT， Mohan S, et al. Combined magnetic fieds increase insuline-like growthfactor I in TE-85 human osteosarcoma bone cell cultures. Endocrinology， 1995, 136 (7): 3100.
13 Zhung HM, Wei W, Seldes RM, et al. Electrical stimulation in-ducess the level of TGF-β1 mRNA in osteoblastic cells by a mechanism involving calcium/calmodulin pathway. Biochem Biophy Res Commu， 1997,237 (2):225.
14 Nagai M, Ots M.Pulsing electromagnetic fields stimulates mRNA expression of bone morphogenetic protein-2 and-4. JDent Res,1994,73(10):1601.
15 刘忠厚.骨质疏松症.北京：化学工业出版社，1992，126.
16 史轶蔡. 协和内分泌和代谢学. 北京:科学出版社，1999，630-647.
作者单位：1 518060 广东深圳，深圳大学生命科学学院（Δ通讯作者）
2 518067 广东深圳，深圳市蛇口人民医院
(编辑：悦 铭)