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致病性大肠杆菌有不同的血清型，这些不同的血清型在致病性上差异较大，如产毒性大肠杆菌常引发毒素性食物中毒，而O157可以引起严重的出血性结肠炎［1］。在临床诊断治疗和流行病调查中，要对致病性大肠杆菌菌株进行快速分离鉴定。常规分离培养及血清学鉴定往往需要3～5天的时间，延误疾病的治疗和疫情的控制。从生物学特性上进行亚种的鉴定往往比较困难，也很难追踪菌株的流行态势。从基因水平进行属种乃至亚种的鉴定不但可以快速鉴定病原菌的种属，还可以进一步追踪病原菌的亚种、血清型及遗传上的亲缘关系。建立在PCR基础上的RFLP和SSCP技术，就是通过扩增病原菌的特异性基因片段，然后通过酶切分析法、单链构象多态性分析进行属［2］的鉴定、甚至属内种的鉴定［3］。即使是同种细菌的不同亚种、血清型，由于其时间、地点来源的不同，在基因水平上会出现一定的变异，这些变异为追踪菌株的来源和进化关系提供了方便。SSCP技术甚至可以检测出基因片段中单个碱基的改变。本文旨在探讨选取GroEL基因片段，运用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术，进行大肠杆菌不同血清型别的鉴定，以期为临床快速鉴别诊断及流行病学调查提供方法依据。
1 材料和方法
1.1 菌株的来源 标准菌株选取6株5种不同血清型大肠杆菌。另选取葡萄球菌属种的金黄色葡萄球菌1株作为研究中的对照菌株。以上所有菌株均为本室保存的标准菌株。将菌株复苏后接种于相应的增菌培养基培养24h后转种至相应的选择培养基养24～36h。
1.2 菌株DNA的提取 纯种菌株接种LB平板37℃培养24～36h后，挑取2～3个单个菌落与100μl灭菌纯水研磨混匀，95℃10min，10000×g离心1min，取上清作为DNA模板。
1.3 GroEL基因扩增引物的选择 从GenBank中提取大肠杆菌的GroEL基因序列，运用DNASTAR软件选取细菌保守区进行引物设计，预计扩增产物占全长基因的2/3以利于细菌的变异性分析。引物序列是：P上游5’AGTTACCCT（CT）GG（TC）CC（AG）AAAG3’（对应于大肠杆菌GroEL基因84-103位核苷酸）；P下游5’CAGCAACCACGCCTTCTTC3，（对应于大肠杆菌GroEL基因1240-1218位核苷酸）。扩增长度约为1.1kbp。
1.4 GroEL基因片段的扩增与纯化 50μl的PCR反应体系中含10×PCR buffer 5μl， 20mM dNTP 4μl，2mM MgCl23μl，上、下游引物各25pmol（1μl），菌株DNA模板1μl，Taq 酶5U（1μl），补加灭菌蒸馏水至50μl。 扩增过程为95℃变性5min，95℃ 60s、55℃ 90s、72℃ 120s循环40次，72℃延伸10min以扩增出所有目的菌株的GroEL基因片段。
1.5 GroEL基因片段扩增产物的酶切 运用DNASTAR软件，寻找扩增片段内的酶切位点，为便于进行PCR产物的鉴定，选择含单个酶切点的内切酶；为便于进行RFLP和SSCP分析，选择含多个酶切点的内切酶。结果选取限制性内切酶EcoRV进行GroEL基因片段的酶切分析，选取限制性内切酶PstⅠ进行GroEL基因扩增片段的RFLP和SSCP分析。20μl酶切反应体系含10×酶切缓冲液2μl，1mg/mlBSA 2μl，PCR纯化产物3μl（1μg），限制性内切酶1μl（3～4U），补足ddH2O至20μl，在37℃酶切2.5h。
1.6 RFLP分析 酶切产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶60V电泳2h，电泳结束后，用快速银染法染色，具体是：将电泳后的聚丙烯酰胺凝胶置固定液1（10%乙酸）中固定30min，用纯水洗3次，每次2min，然后置银染色液（0.1%AgNO3，0.036%甲醛）中染色20min，轻轻摇动，用纯水洗5～10s，在显色液（2.5%碳酸钠，0.036%甲醛，0.002%硫代硫酸钠）中显色3～10min至所需深度。终止液（1.46%EDTA）终止10min，固定液2（28.8%乙醇，16.7%甘油）固定10min，室温干燥2h，观察结果并照相。
1.7 SSCP分析 5μl酶切产物与5μl变性液（5mM EDTA，0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯青FF溶于甲酰胺中）混匀，95℃变性7min，立即置冰上放置10 min，取3～4μl加样于10%聚丙烯酰胺凝胶（8.3cm×7.5cm），在Bio-Rad电泳仪上4℃100V电泳30min，280V电泳60min。电泳结束后行快速银染法染色。
2 结果
2.1 大肠杆菌不同血清型GroEL基因片段扩增产物的RFLP分析 对6株5种不同血清型大肠杆菌GroEL基因片段扩增产物经PstⅠ酶切后，经8%非变性聚丙烯酰胺60V电泳2h，银染后6株细菌均有其特异的RFLP图谱，其中EIEC与EAggEC大肠杆菌RFLP图谱与其他3种血清型RFLP图谱差异较大，而ETEC、EHEC和EPEC的RFLP图谱相似，所有5种不同血清型大肠杆菌RFLP图谱在一些条带是不变的。由于金黄色葡萄球菌在扩增片段内无PstⅠ酶切位点，故在RFLP和SSCP分析中略去其与大肠杆菌间的比较。
2.2 大肠杆菌不同血清型GroEL基因片段扩增产物的SSCP分析 对大肠杆菌不同血清型GroEL基因片段扩增产物经PstⅠ酶切后，酶切产物与变性液变性后，经10%聚丙烯酰胺凝胶，在100V电泳30min，280V电泳60min，经银染后每种血清型大肠杆菌经酶切后出现比RFLP更多的条带，这一方面可能是由于细菌中存在不同的GroEL基因拷贝，在多拷贝基因中存在不同的变异，另一方面，酶切产物的单链与双链的同时存在。对于具有相似RFLP图谱的ETEC、EHEC和EPEC，在相应的SSCP分析图谱中，EHEC在100～300bp间出现不同的带型，EPEC在100bp左右出现不同的带型，这有助于区分这3个血清型大肠杆菌。对于EIEC与EAggEC大肠杆菌，在SSCP图谱中仍表现与其他血清型大肠杆菌不同。在同一血清型（如ETEC）的不同分离株中，可出现略有不同的图谱，这可能是不同分离株间出现了核苷酸的变异所致。
3 讨论
运用PCR-RFLP和PCR-SSCP进行基因突变和变异性分析已在很多方面进行了广泛的应用。RFLP可以对细菌的基因性进行初步的分析，SSCP可以检测到基因的点突变水平，可以利用简单RELP技术对临床巴尔通氏体属的4个亚种进行快速区分［2］。利用PCR-SSCP技术可以对沙门氏菌的不同血清型进行快速鉴定。
本研究通过RFLP和SSCP的结合，分析了其在大肠杆菌不同血清型鉴别中的可行性。首先运用细菌通用保守基因GroEL作为靶基因，选取其中的特异区段作为鉴定片段，通过PCR扩增使靶信号放大，选择该片段内的多位点限制性内切酶进行酶切，每种血清型大肠杆菌都有其特征性的RFLP或图谱，据此可以进行初步鉴定，即使某种细菌在酶切位点发生变异，但不影响其他位点的酶切效果，依然可以进行种属属性的鉴定，运用PCR-SSCP技术，可以发现不同血清型大肠杆菌的SSCP图谱是有差异的，根据这种差异一方面反映了不同血清型基因的变异性，据此可以将不同的血清型进一步区分开来。同时，在同一血清型的不同分离株间，也会出现个别的核苷酸变异现象，这在流行病学研究上有重要的意义。
【参考文献】
1 张缓.消毒剂对大肠杆菌O157:H7的杀灭效果及应用研究.现代预防医学，2006,33(9):1546.
2 Matar GM,Koehler JE,Malcolm G,et al. Identification of Bartonella species directly in clinical specimensby PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of a 16S rRNA gene fragment.J.Clin Microbiol,1999,37(12):4045-4047.
3 Scheinert P,Krausse R,Ullmann U,et al.Molecular differention of bacteria by PCR amplification of 16S-23S rRNA spacer,J Microbiol Methods,1996(26):103-117.
作者单位：518040 广东深圳,深圳市福田区疾病预防控制中心
(编辑：悦 铭)