点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨外源性5-HT神经细胞移植对慢性不可预见性应激大鼠多内脏器官损伤的作用。方法 将40只雄性SD大鼠（购置第二军医大学实验动物中心）随机分为4组（10只/组）：正常对照组（Ⅰ）、慢性应激组（Ⅱ）、慢性应激细胞移植组（Ⅲ）、慢性应激氟西汀治疗组（Ⅳ）。采用慢性不可预见性应激抑郁模型法造模后，将5-HT神经细胞1次性移植于Ⅲ组大鼠的蛛网膜下腔，Ⅳ组每天给药1次3周；经Open-fie1d行为测试，解剖观察、取材、切片，HE和免疫组化法等染色，镜下观察。结果 （1）与Ⅱ组相比，Ⅲ和Ⅳ组大鼠行为明显改善；（2）大体解剖显示：Ⅱ组大鼠肺出现灶状充血，30％出现肺脓肿现象；Ⅲ组大鼠肺病变明显减轻，未见肺脓肿发生；（3）HE和免疫组化染色：Ⅱ组大鼠出现胃腺萎缩，肺组织间炎症细胞增多；Ⅲ和Ⅳ组大鼠胃腺和食管黏膜上皮萎缩以及肺组织炎症反应减轻，5-HT免疫反应增强，阳性细胞数目增多，与Ⅱ组相比差异有显著性（P<0.01）；Ⅲ组与Ⅰ、Ⅳ组相比差异无统计学意义（P>0.05）。结论 5-HT神经细胞移植对慢性不可预见性抑郁症大鼠多器官损伤具有改善作用,其机制可能与移植细胞释放5-HT，调节了中枢至周围神经的胆碱能抗炎通路，并促进了周围器官的5-HT合成有关。
【关键词】 5-羟色氨； 细胞移植；抑郁症；氟西汀
The effect and possible mechanisms with transplantation of 5-HT(hydroxytryptamine)cell for the multiorgan lesions on the rats by chronic unpredictable depression
WU Ai-qun，XU Jin-ming，ZHOU Qiang,et al.
Department of Human Anatomy, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China
【Abstract】 Objective To explore the effect and mechanisms with transplantation of serotonergic neurons on rats by chronic unpredictable stress. Methods 40 male rats (purchased from the experimental animal center of Second Military Medical University) were randomly divided into four groups: control group (Ⅰ), chronic stress group (Ⅱ), chronic stress model transplanted stress cells (Ⅲ), and chronic stress model treated with fluoxetine (Ⅳ). The model induced with the chronic unpredictable stress, Ⅲ group were transplanted the serotonergic cells once into the subarachnoid space of the rats, Ⅳgroup were administered once a day for 3 weeks; All animals of each group measured behaviorally, observed anatomically and analyzed statistically using HE and immunohistochemical method. Results （1）compared with Ⅱ group, the behaviour of the rats in Ⅲ and Ⅳ groups improved obviously；（2）the gross anatomy shown：the lungs of the rats in Ⅱ group appeared focal congestion, 30％ suffered from the pulmonary abscess；the lesions of the lung in Ⅲ group were reduced，none of them was found the pulmonary abscess;（3）HE and immunohistochemical staining : the gastric gland cell presented atrophy and a numbers of the inflammatory cell presented in the pulmonary tissue of group Ⅱ; the atrophy of the gastric gland cell and esophageal mucous membrane and the inflammation of the lung in the group Ⅲ and Ⅳ were slighter; 5-HT immunohistochemical reaction heightened and the number of the positive cells was more in the group Ⅲ and Ⅳ than in group Ⅱ（P<0.01）. But there was no significant differences on the lesion degree of their organs between Ⅲ and Ⅰ,Ⅳ（P>0.05）. Conclusion The transplantation of serotonergic neurons plays a improving role on lesion of many organ in the rats by chronic unpredictable stress, the mechanism may be related to the transplantation of the serotonergic neurons coordinating the central nervous pathways and promoting 5-HT synthesis of the relevant cells in the ambient organs.
【Key words】serotonin; cell transplantation; depression; fluoxetine
慢性应激可导致机体不同程度的伤害与许多器官的疾病［1］，但其发病机制尚不十分清楚，有关病因学主要认为心理社会因素和遗传因素，长期作用于中枢神经而使神经通路失调和下丘脑-垂体-内分泌轴调节紊乱（肾上腺轴功能亢进）所致。许多研究资料报道［2，3］，抑郁症神经递质的异常主要表现为脑的5-羟色胺（5-HT）合成减少，病理尸检的脑组织内（脑干和额叶）5-HT含量降低以及海马5-HT受体总量减少。解剖学研究显示5-HT细胞较多分布于胃肠的嗜铬细胞（90%）和脑干中缝核（2%），中缝核的上、下行纤维广泛投射到脑和脊髓。生理学研究证实中缝核、下丘脑、海马等处的5-HT神经元和纤维与睡眠、情绪和行为调节有关。临床应用5-HT再摄取抑制剂氟西汀治疗或提高脑内5-HT水平治疗抑郁症有效，动物实验表明氟西汀可使5-HT受体表达增多［4～6］，提示采用延长或增强5-HT作用的方法可能获得防治抑郁症或慢性应激损伤的效果。为此，本文采用国际公认的慢性不可预见抑郁症模型和5-HT细胞移植的方法，研究了5-HT神经元移植对慢性应激所致抑郁症与多器官损伤的影响，为进一步阐明抑郁症的发病机制，并为临床防治抑郁症开辟新的治疗途径提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
成年雄性SD大鼠，体重120～140g，由上海第二军医大学动物中心提供，经Open-field法行为学评分，选择评分相近的40只动物，随机分为4组（n＝10 /组）：正常对照组（Ⅰ）、抑郁模型组（Ⅱ）、抑郁模型细胞移植组（Ⅲ）、抑郁模型氟西汀治疗组（Ⅳ）。以慢性不可预见性抑郁模型法造模后，对照组动物5只/笼，应激组1只/笼，自由饮食,光/暗周期为12h/12h(光照时间6:00～18:00),背景噪音为（40±10）分贝,温度为（20±3）℃。
1.2 慢性不可预见性抑郁症动物模型的建立［7，8］
抑郁症模型鼠接受21天不同的应激:电击足底(1.0mA，每次10ks，间隔1min刺激1次，共30次)；禁食24h；4℃冷水游泳5min；休息24h；45℃热应激5min；摇晃1次/s，15min；昼夜颠倒24h，夹尾1min。分别在试验前1天和试验开始后第7、14和21天，观测其行为变化。
1．3 5-HT细胞移植与氟西汀给药
取培养14天的胎鼠脑桥和中脑中缝区5-HT神经细胞离心后，将细胞浓度调整为5×107个/ml；每只模型鼠在麻醉下，固定为俯卧位，自腰背部打开椎管，用微量注射器穿硬脊膜行蛛网膜下腔注入细胞悬液5μl（对照组同方法注入5μl生理盐水），检查术区无出血，逐层缝合关闭切口，放回笼内饲养。抑郁症动物模型制模结束后,次日开始每天在规定时间内腹腔注射盐酸氟西汀,剂量为2mg/（kg·d）×14d。
1．4 行为活动测定（Open-field test）
分别在第0、7、14和22天，将试验动物置于高50cm，直径80cm，底壁等分标界的圆柱形敞箱内，光照度约60Lux，室内隔音，记录动物行为，每次测定时间3min。以穿越底壁块数为水平活动（Crossing）得分，直立次数为垂直活动（Rearing）得分。同时，测定动物理毛时间(Grooming Time），等待时间（Waiting Time）即动物从进入敞箱到开始活动的时间，每只动物仅进行一次行为测定。
1．5 动物处理
（1）40mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，开胸，经左心室升主动脉插管，剪开右心房，先灌注生理盐水 250ml，继以灌流4%多聚甲醛150ml，持续30min。（2）各组胸腹部大体解剖观察食管、胃和肺，于相同部位的组织取材，4％多聚甲醛后固定6～12h，石蜡包埋、切片，片厚6μm。
1．6 染色与观察
将切片经3%的正常山羊血清和0.3%的Triton X-100 PBS孵育40min，然后直接加入稀释成1:500的5-HT抗体(BD生物公司)，4℃过夜，再加入二抗孵育液（1：200）37℃ 2h, DAB显色，中性树胶封片，显微镜下观察。
1．7 统计学处理
实验数据采用图像分析，以算术平均数±标准差（x±s）表示，使用SPSS（10.0）统计软件对数据首先进行正态检验，然后进行t检验（或单因素方差分析，方差不齐进行变量转换），以α＝0.05为检验水准。
2 结果
2．1 抑郁模型鼠体重和行为变化
以后3天的结果作比较，Ⅱ组大鼠行为学变化与Ⅰ组相比, 水平活动和垂直活动次数、理毛时间均明显下降，等待时间显著延长（P<0.05）；Ⅲ、Ⅳ组与Ⅱ组相比，水平活动和垂直活动次数、理毛时间均增加，等待时间显著缩短，差异有显著性（P<0.05）。Ⅱ组大鼠体重增加量与Ⅰ组相比显著减少（P<0.05）；Ⅲ、Ⅳ组大鼠体重增加量较Ⅱ组明显增多，差异均有显著性（P<0.05）。而Ⅲ组大鼠行为学和体重变化与Ⅰ、Ⅳ组相比，无统计学意义（P>0.05）（见表1）。表1 慢性应激与细胞移植后大鼠敞箱行为的比较（略）注：Ⅰ组与Ⅱ组，或Ⅱ组与Ⅲ、Ⅳ组相比，P＜0.05；Ⅰ组与Ⅲ、Ⅳ组相比， P>0.05
2．2 抑郁模型鼠大体解剖
Ⅱ、Ⅲ组与Ⅰ组相比，大鼠食管较细，胃较小，壁薄，Ⅲ组较Ⅱ组者明显改观，Ⅲ与Ⅳ组差别不明显；Ⅱ组肺胸肋面色泽不均，可见灶状充血，25%大鼠的肺出现结节状或大叶状脓肿；Ⅲ、Ⅳ组与Ⅱ组相比，肺表面形态有明显改善。
2．3 HE和免疫组化染色
与Ⅰ组相比，Ⅱ组肺组织间炎症细胞增多或明显聚集，Ⅲ、Ⅳ组大鼠肺组织炎症细胞明显减少；Ⅱ组大鼠食管黏膜层变薄，胃底腺细胞变小，腺体变窄，呈现萎缩状；Ⅲ、Ⅳ组萎缩不明显。5-HT细胞免疫阳性反应呈棕黄色。Ⅱ组与Ⅰ组相比，大鼠肺泡壁细胞、食管黏膜层细胞显色变浅（图1，图2）；各组大鼠胃底腺5-HT阳性细胞分别为（96.26±13.22）%、（36.35±18.26）%、（93.18±16.12）%、（92.21±19.13）%，Ⅱ组较Ⅰ组胃底腺5-HT阳性细胞明显减少，Ⅲ、Ⅳ组与Ⅱ组相比，5-HT阳性细胞数目增多，差异有显著性（P<0.01），且着色加深（图3）；Ⅲ、Ⅳ组与Ⅰ组相比差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
3.1 5-HT神经元移植对抑郁模型鼠体重和行为变化的影响
我们制作的慢性不可预见性应激大鼠表现为多项行为异常［9］，以及其额叶皮层和海马结构的器质性改变，如神经元尼氏体脱颗粒，退行性变，部分细胞丢失，表明了模型的成功建立。有关其发病机制普遍认为，下丘脑-垂体-内分泌轴调节紊乱（肾上腺轴功能亢进）、生化代谢障碍［10］、脑的5-羟色胺（5-HT）含量降低以及海马5-HT受体总量减少等反应所致［6］。不少实验证明应用5-HT在摄取抑制剂氟西汀可改善抑郁症动物的病理症状［6］。本试验发现， 5-HT神经细胞-蛛网膜下腔移植后可使抑郁症大鼠的水平活动和垂直活动次数、理毛时间增加，等待时间显著缩短，与非治疗组相比差异有显著性（P＜0.05）。结果表明5-HT神经细胞-蛛网膜下腔移植具有改善抑郁症大鼠异常行为的作用，可产生与氟西汀相似的效应。分析其作用机制可能与移植的细胞分泌和提高了脑脊液内5-HT浓度，调节了紊乱的中枢神经通路有关。
3.2 5-HT神经元移植对抑郁模型鼠多器官损伤的影响
早有研究发现应激可引起胃溃疡等，近来还有临床分析报道内脏肿瘤亦与精神抑郁有关［11］。我们的实验显示，慢性不可预见性应激抑郁模型鼠则出现食管和胃壁黏膜萎缩，肺灶状充血，或肺脓肿；镜下可见胃黏膜腺体变窄；肺间质炎症细胞增多，或灶状，或大片脓细胞聚集。结果表明长期慢性不可预见性应激亦可诱发胃萎缩、肺间质炎症和肺脓肿等多器官损伤。5-HT神经细胞-蛛网膜下腔移植的抑郁症大鼠，其胃萎缩和肺间质炎症减轻，与非治疗组相比差异有显著性（P＜0.05），结果较氟西汀作用较好，但无统计学意义（P>0.05）。由此表明5-HT神经细胞移植具有减轻慢性应激引起多器官损伤的作用，对用于临床治疗抑郁症具有潜在的可能性。
3.3 5-HT神经元移植减轻抑郁模型鼠多器官损伤的可能性机制
我们的实验结果显示，慢性应激大鼠已出现了中枢损伤（行为异常）、内脏损伤（食管、胃和肺出现病理改变）等多器官损伤的病理表现。根据神经解剖学证实的5-HT神经核由中枢至周围内脏的神经通路：脑干中缝核（纤维）→脑干和脊髓的内脏神经核团（纤维）→迷走神经和交感神经→内脏，表明脑干5-HT神经调节着内脏的各种机能。近年来，神经-免疫的胆碱能抗炎通路（cholinergic antiinflammatory pathway）越来越受到国内外重视。有研究报道［12］, 抑郁症患者外周血5- HT水平降低，其含量与爱丁保抑郁量表评价总分(PPDS) 呈显著性负相关。干扰素治疗常见的副作用是其可引起抑郁症，联合应用5-HT再摄取氟阻滞剂氟西汀可降低抑郁症发病率［12，13］。国外有研究报道［14，15］，刺激迷走神经对内毒素引起的内脏损伤具有保护作用。由此表明，慢性应激引起的多器官损伤和细胞功能不足，可能与耗竭5-HT或损伤5-HT神经元的合成功能，最终使中枢与外周的5-HT减少，胆碱能抗炎功能不足，导致效应细胞的功能下降有关。
我们的研究还发现，5-HT细胞移植能产生对慢性应激的治疗作用（慢性应激组的食管、胃和肺的病理改变明显减轻）。结果表明5-HT神经元移植后减轻了应激性多器官损伤的病理变化。根据5-HT-迷走神经-胆碱能抗炎通路分析其作用机制，可能与移植的5-HT细胞经分泌5-HT调节了中枢至周围的迷走神经通路，增强了胆碱能抗炎通路的保护作用有关，即通过移植细胞的分泌作用，不同程度地纠正了内脏核团的功能失常，进而增强了迷走神经-胆碱能通路的抗炎作用，并改善了外周的5-HT细胞功能，减轻了应激性器官的损伤等，但其确切作用机制尚需进一步研究。
作者单位：1 200433 上海，第二军医大学解剖学教研室 2 200433 上海，第二军医大学长海医院神经内科